鄧嘉強 井秀娜 林淡鈺 卜璐璐 陳穎 陶恩祥

帕金森病（PD）是常見神經(jīng)退行性疾病，主要以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性和路易小體的形成為病理特征。目前PD 確切的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，最近研究表明持續(xù)存在的免疫反應參與了帕金森病的發(fā)病機制［1］。神經(jīng)炎癥在死后PD 患者大腦中仍存有明顯的病變特征，NLRP3炎癥小體是PD 病理過程中發(fā)揮主要調(diào)控作用的炎癥小體，異常聚集的α?syn 能激活NLRP3炎癥小體誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導致多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失［2］。因此，抑制NLRP3炎癥小體的激活，可作為治療PD 的重要方案。

有研究發(fā)現(xiàn)，在抑制PKR 活化后可以抑制NLRP3炎癥小體的激活和IL?1β 的成熟和分泌［3］。利福平可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來減輕小膠質(zhì)細胞炎癥毒性［4］，并且利福平可以抑制PERK?eIF2α?ATF4 通路緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激保護多巴胺能神經(jīng)元［5］。PKR 與PERK 都是eIF2α 系列分子，siRNA 靶向PERK 能抑制PKR 活化［6］。因此，我們猜測利福平能通過抑制PKR 活化減輕神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護作用。為進一步驗證利福平抑制PKR 活化緩解神經(jīng)炎癥，我們觀察了利福平對魚藤酮誘導下BV2細胞內(nèi)p?PKR、Caspase?1、NLRP3、IL?1β 等蛋白的表達水平的影響，進一步探索了利福平抑制神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護作用的相關機制，旨在為帕金森病的治療和預防提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料 DMEM 培養(yǎng)基、D/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司；Rotenone 購自美國APExBio 公司；Rifampicin 購自美國Sigma 公司；C16（PKR 抑制劑）購自美國Merck?Millipore 公司；兔抗PKR 抗體購自美國艾菲公司；兔抗phos?phoT446?PKR 抗體購自美國SAB 公司，兔抗IL?1β抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗Caspase?1 抗體購自美國Abcam 公司；β?actin 抗體購自美國Abcam，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自美國CST 公司；細胞凋亡試劑盒購自美國BD 公司；6 孔Transwell細胞共培養(yǎng)小室購自Corning 公司。

1.2 主要方法 （1）細胞培養(yǎng)用D/F12 培養(yǎng)基重懸細胞，1000 r/min 離心5min 棄去上清，細胞接種在含有10%胎牛血清（FBS）的D/F12 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用PBS洗1 遍再更換培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%時，用胰蛋白酶消化下來后，按1∶5 進行傳代。（2）實驗分組實驗分為5 組，（1）空白對照組（2）魚藤酮組（3）利福平組（4）利福平預處理組（5）C16 預處理組。

1.3 Western blot 法檢測利福平預處理對魚藤酮誘導的p?PKR、PKR、NLRP3、Caspase?1、IL?1β 表達的影響 各組細胞按2.2 分組，經(jīng)藥物孵育后，用細胞裂解液在冰上裂解，12000 r/min 離心30 min 后收集上清。用BCA 蛋白分析試劑盒測定各組蛋白濃度。以每組蛋白上樣量為20 μg 進行SDS?PAGE 凝膠電泳。取適量的蛋白進行蛋白變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次。用ECL 發(fā)光液在成像儀中成像顯影，用ImageJ 軟件對獲得的蛋白條帶圖像進行分析。

1.4 細胞共培養(yǎng) 將重懸的BV2 細胞按3×105個/孔的密度接種在共培養(yǎng)皿的下室，用含有10%血清的D/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時SH?SY5Y 細胞以3×105個/孔的密度接種在共培養(yǎng)皿的上室，待細胞貼壁后按上述實驗分組情況進行藥物孵育處理。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 胰酶消化收集共培養(yǎng)皿上室中SH?SY5Y 細胞，離心棄掉上清后，再用2 mL PBS 清洗細胞，1000 r/min，離心5 分鐘，設置1 個空白對照和5 個實驗組，每個實驗組加入5 μL V450?A 試劑混勻，于室溫避光反應10-15 min 后，再加入10 μL PI 試劑混勻，半小時內(nèi)完成上機檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析 我們進行了3 個獨立的實驗，所有的實驗條件被重復或三次測試，應用Graph?pad Prism 軟件分析實驗數(shù)據(jù)和作圖，定量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA）統(tǒng)計方法，當P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 利福平可以抑制PKR 磷酸化 見圖1。

圖1 利福平可以抑制魚藤酮誘導的小膠質(zhì)細胞中PKR 活化

2.2 利福平可通過抑制PKR 活化調(diào)節(jié)魚藤酮誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥 見圖2。

2.3 利福平可通過抑制PKR 活化減輕神經(jīng)炎癥介導的細胞凋亡 見圖3。

圖2 利福平通過抑制PKR 活化對NLRP3、IL?1β、Caspase?1 等蛋白表達的影響

3 討 論

各種致病因素刺激小膠質(zhì)細胞活化釋放各種促炎癥因子加劇神經(jīng)元變性、丟失，在A53T 基因突變的PD 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)部位大量活化的小膠質(zhì)細胞，且出現(xiàn)PD 相關的異常行為學特征［7］。相比健康人群，PD 患者的腦脊液和血液等生物液檢測發(fā)現(xiàn)IL?1β、NLRP3炎癥小體表達水平明顯升高［8］。因此，阻斷神經(jīng)炎癥可以延緩腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性、壞死，對PD 患者的治療和預防起著重要的作用。

炎癥小體的激活可以引導先天免疫系統(tǒng)對致病刺激的反應和致病物質(zhì)的產(chǎn)生，NLRP3炎癥小體是近幾年來研究最廣泛的一種，小膠質(zhì)細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活釋放各種細胞因子，這些炎性物質(zhì)又進一步激活NLRP3炎癥小體，導致惡性循環(huán)形成［9］。因此，抑制NLRP3激活來緩解神經(jīng)炎癥誘導的神經(jīng)元損傷，為神經(jīng)退行性疾病治療提供新的指導。

圖3 利福平通過抑制PKR 活化減輕小膠質(zhì)細胞炎癥誘導的SH?SY5Y 細胞凋亡

在PD 患者腦組織切片中發(fā)現(xiàn)退化神經(jīng)元中磷酸化PKR 表達水平上調(diào)，促使多巴胺神經(jīng)元變性和丟失，PKR 可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活、Caspase?1 的活化和IL?1β 的成熟，惡化神經(jīng)炎癥反應，而抑制PKR 活化能有效減輕相應的炎癥反應［11］。由此可知，PKR 活化對NLRP3炎癥小體激活在神經(jīng)退行性疾病中起重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，魚藤酮組發(fā)現(xiàn)p?PKR、NLRP3、IL?1β、Caspase?1 等蛋白的表達水平均明顯上調(diào)，而利福平組無改變。利福平預處理組或C16 預處理組，以上蛋白的表達水平得到逆轉(zhuǎn)。

PKR 活化調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體依賴性細胞因子的釋放。由此可見，抑制PKR 活化可減輕NLRP3誘發(fā)的神經(jīng)炎癥，為慢性神經(jīng)退行性疾病的治療和進展提供了新的方向。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，用接受不同處理的BV2 小膠質(zhì)細胞與SH?SY5Y 細胞共培養(yǎng)24 小時后，用流式細胞術檢測細胞凋亡率。與空白組相比，魚藤酮組細胞凋亡水平明顯升高，利福平組細胞凋亡水平?jīng)]有變化。與魚藤酮組相比，利福平預處理組或C16 預處理組，細胞凋亡水平出現(xiàn)反轉(zhuǎn)。

綜上所述，PKR 誘導的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性病變過程中起著重要作用。利福平減輕小膠質(zhì)細胞炎癥介導的細胞損傷，這可能與利福平調(diào)控PKR 活化有關。本實驗研究擴展了利福平對神經(jīng)元的保護作用，若能進一步明確利福平抑制過表達PKR 誘導NLRP3炎癥小體的激活的調(diào)控機制，將為新型抗PD 藥物研發(fā)提供新的指導。