劉志鋒 葉浩翊 阮耀欽 伍志華 楊正飛
腦損傷是心臟驟停(cardiac arrest,CA)幸存者死亡的主要原因,隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)技術(shù)革新,死亡率逐年降低[1]。然而,仍然有超過75%的幸存者出現(xiàn)腦損傷而致殘[2]。早期評估CA/CPR 后腦損傷及預(yù)測患者預(yù)后對臨床調(diào)整治療策略十分重要。研究[3]發(fā)現(xiàn)核磁共振彌散加權(quán)成像(diffusion?weighted magnetic resonance imaging,DWI)可以評估CA/CPR 后腦水腫預(yù)測患者預(yù)后,然而DWI 檢查的最優(yōu)時間點仍然沒有形成共識,是否存在某一些時間點不適用于評估腦水腫?基于這一臨床科學(xué)問題,我們設(shè)計了一組動物實驗,建立大鼠CA 模型分別在CA/CPR 后恢復(fù)自主循環(huán)(return of spontaneous circulation,ROSC)6 及24 小時后行DWI 檢查,對比分析兩個檢查時間點對評估CA/CPR 后腦水腫的價值,為臨床提供實驗性研究數(shù)據(jù)。
1.1 心臟驟停模型分組及制作 將20 只體重為(506±13)g 的雄性SD 大鼠放在無菌房間內(nèi)飼養(yǎng),該房間在恒溫(20-22℃)下光照和黑暗均12 小時。將大鼠隨機(jī)分為sham 組(n=6)、ROSC6h 組(n=7)及ROSC24 組(n=7),采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射45 mg/kg 麻醉大鼠使用自制心肺復(fù)蘇參考先前研究方法制作大鼠窒息CA 模型[4]。假手術(shù)組動物進(jìn)行了相同的手術(shù),但沒有誘導(dǎo)窒息。本研究為前瞻性對照實驗研究,本研究采用的實驗動物均取得廣東省實驗動物質(zhì)量合格證明,本實驗得到了廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。
1.2 儀器與方法 所有大鼠模型掃描均使用GE 1.5T MRI 成像儀(GE 1.5T Signa HDi,美國)和橫向1.5T 8 通道大鼠專用線圈(CG?MUC44?H150?AG,上海晨光有限公司)進(jìn)行。各組大鼠均通過腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)進(jìn)行麻醉,將大鼠模型固定在線圈中,保持俯臥姿勢行DWI 序列橫斷位掃描。TR 3000 ms,TE 125 ms,矩陣128×192,F(xiàn)OV 80 mm×80 mm,層厚2.5 mm,層間距0.8 mm,信號激勵次數(shù)8 次,采集時間1.5分鐘。
1.3 各組大鼠全腦ADC 值測量 各組大鼠全腦ADC 值由兩名具有5 年以上工作經(jīng)驗的放射科醫(yī)生獨立測量,并取兩名測量者平均值。選擇大鼠全腦(橫斷面經(jīng)海馬包括小腦及大腦的最大層面)作為感興趣的區(qū)域(ROI)。使用GE 后處理工作站Functool 軟件測量大鼠全腦ADC 值。
1.4 免疫組化方法 將大鼠斷頭取腦組織用4%中性緩沖甲醛固定24 小時后制作成石蠟組織塊,石蠟組織以4 μm 厚切片,防脫載玻片撈片,使用MaxVisionTMHRP 免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行水通道蛋白4(aquaporin?4,AQP4)染色,具體步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。
1.5 統(tǒng)計方法 運(yùn)用SPSS 25 軟件包(SPSS,Chi?cago,IL)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量計量資料以(±s)表示,分類變量以百分比(%)表示,各組間的比較使用方差分析(one?way ANOVA),若數(shù)據(jù)方差齊時兩兩比較采用L?S?D 檢驗,方差不齊時采用Dunnett's T3 法檢驗。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
本研究共使用了20 只SD 雄性大鼠,14 只大鼠接受了CPR,12 只大鼠成功ROSC(12/14,85.7%)其中2 只未能ROSC(2/14,14.3%),其余6 只大鼠接受了假手術(shù)。
2.1 各組大鼠的基線特征和CPR 特征 見表1。
表1 各組大鼠基線生理參數(shù)及CPR 特征(±s)
表1 各組大鼠基線生理參數(shù)及CPR 特征(±s)
注:ROSC=return of spontaneous circulation;各組間比較P 值均>0.05。
變量體重(g)心率(次/分鐘)呼氣末CO2分壓(mm Hg)平均動脈壓(mm Hg)動脈血pH 值氧分壓(mm Hg)動脈血乳酸(mmol/L)窒息時間(分鐘)心臟按壓時間(分鐘)sham(n=6)516±19 395±27 42±2 122±7 7.32±0.04 93±12 1.1±0.3--ROSC6h(n=6)514±21 403±30 41±3 119±14 7.41±0.05 94±13 1.2±0.4 10.3±0.9 3.8±1.2 ROSC24 h(n=6)517±20 409±28 44±3 121±11 7.39±0.03 92±14 1.2±0.3 10.8±1.1 3.9±1.7
2.2 各組大鼠的全腦DWI 分析 見圖1、表2。
2.2 各組大鼠的AQP4 免疫組化分析 見圖2。圖2. 各組大鼠AQP4 抗體免疫組化DAB 顯色(放大倍數(shù)200×)。A、sham 組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AQP4抗體表達(dá)陰性;B、ROSC6h 組神經(jīng)細(xì)胞AQP4 抗體表達(dá)強(qiáng)陽性;C、ROSC24h 組神經(jīng)細(xì)胞AQP4 抗體表達(dá)陽性。
圖1 各組大鼠模型DWI 圖像。Sham 組(A)、ROSC6h 組(B)及ROSC24 h 組(C)DWI 圖像均未見異常信號
表2 各組大鼠全腦ADC 值比較
圖2 各組大鼠AQP4 抗體免疫組化DAB 顯色(放大倍數(shù)200×)
CA/CPR 后的腦缺血-再灌注損傷是臨床預(yù)后的主要決定因素,它的起因是由于腦氧輸送的減少,引起一系列復(fù)雜的病理生理級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致血腦屏障破壞,腦代謝異常和腦水腫等[5]。在這項研究中,比較了大鼠CA/CPR 后在ROSC 6 h 和24 h的全腦ADC 值。結(jié)果表明,大鼠CA/CPR 后出現(xiàn)腦水腫,ADC 值在復(fù)蘇早期(ROSC6h)可以評估腦水腫,但是在復(fù)蘇后期(ROSC24h)評估腦水腫受限。DWI 利用水分子擴(kuò)散來成像,提供基于腦生理狀態(tài)的信息,可以檢測并定量評估CA/CPR 后腦水腫的嚴(yán)重程度及預(yù)測患者神經(jīng)預(yù)后[3]。Park JS 等[6]回顧分析36 例院外CA 患者6 小時內(nèi)的DWI 檢查,發(fā)現(xiàn)6 個月后神經(jīng)預(yù)后不良的患者全腦ADC 值明顯下降,均小于700×10-6mm2/s,結(jié)果提示CA 早期出現(xiàn)嚴(yán)重的腦細(xì)胞毒性水腫,ADC 值下降可預(yù)測患者神經(jīng)預(yù)后不良。Hirsch KG 等[3],對51 例在CA 后7 天內(nèi)接受DWI 檢查的患者分析,結(jié)果顯示神經(jīng)預(yù)后不良的患者腦部ADC <650×10-6mm2/s,靈敏度為63%,特異性96%,陽性預(yù)測值為94%。本研究DWI 結(jié)果顯示大鼠復(fù)蘇早期(ROSC6h)ADC 值明顯下降,免疫組化結(jié)果顯示AQP4 抗體表達(dá)強(qiáng)陽性,提示大鼠腦部出現(xiàn)嚴(yán)重的腦水腫,表明ADC 值在復(fù)蘇早期可以評估腦水腫。隨著復(fù)蘇時間的推移,復(fù)蘇后期(ROSC24h)大鼠腦部ADC 值回升,與sham 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,然而免疫組化結(jié)果顯示復(fù)蘇后期(ROSC24h)AQP4 抗體表達(dá)仍為陽性,但是表達(dá)程度較復(fù)蘇早期(ROSC6h)下降,結(jié)果表明在復(fù)蘇后期(ROSC24h)評估腦水腫可能受限。Tang Z 等[7]對比分析豬CA 模型ROSC6h 與72 h 的全腦ADC值,發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)蘇時間推移出現(xiàn)全腦ADC 值回升的現(xiàn)象,與本研究結(jié)果相近。隨著復(fù)蘇后腦血流量的升高,大腦供血供氧恢復(fù),短期內(nèi)腦內(nèi)細(xì)小血管自身調(diào)節(jié)功能逐步恢復(fù),清除了短暫堆積的代謝物質(zhì)后恢復(fù)了細(xì)胞功能所需的內(nèi)環(huán)境,故細(xì)胞毒性水腫好轉(zhuǎn),ADC 值回升;另外,CA/CPR 后血液復(fù)流,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞再灌注損傷,加劇血腦屏障受損而通透性增加,大量的自由水經(jīng)受損的血腦屏障從血管進(jìn)入血管外細(xì)胞外間隙,導(dǎo)致血管源性腦水腫,血管外細(xì)胞外間隙內(nèi)彌散運(yùn)動快的自由水增多,導(dǎo)致彌散系數(shù)增加,故復(fù)蘇后期(ROSC24h)ADC 值上升[8]。
本實驗存在幾點不足之處:第一,本實驗使用健康的大鼠,不能模擬人類真實的疾病狀態(tài);第二,本研究三組大鼠樣本量較少;第三,本實驗只研究了ROSC6h 和24 h 兩個時間點,研究更多的ROSC 時間點有利于了解CA/CPR 后腦水腫演變。綜上所述,ADC 值可用于CA/CPR 后復(fù)蘇早期(ROSC6h)腦水腫評估,但是在復(fù)蘇后期(ROSC24h)評估腦水腫受限。
致謝
本組實驗所有大鼠模型均在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院唐萬春急危重癥實驗室完成。在此向?qū)嶒炇胰w工作人員表示衷心地感謝!