李彪 張小梅 王小小 曾芳 何蕓 關(guān)信民 趙強(qiáng)*

β3腎上腺素能受體（β3?adrenergic receptor，β3?AR）屬于G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein?coupled recep?tors，GPCRs）超家族［1］。研究證實(shí)，與抑制型G 蛋白（inhibitory G protein，Gi）偶聯(lián)的β3?AR 參與了心力衰竭（Heart Failure，HF）的心室重構(gòu)和心室功能下降［2?4］。心臟β3?AR 途徑的激活可能為調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)提供未來(lái)的治療途徑［5］。β3?AR 的激活減少了急性心肌梗死大鼠發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速或心室顫動(dòng) 的 風(fēng) 險(xiǎn)［6］。Salie 等［7］發(fā) 現(xiàn) 對(duì) 于 缺 血 的 大 鼠，BRL37344 對(duì)β3?AR 的激活具有明顯的心臟保護(hù)作用。本研究通過(guò)建立大鼠心肌梗死動(dòng)物模型，初步探討梗死心肌中β3?AR 表達(dá)的變化，及β3?AR 是否對(duì)梗死心肌起保護(hù)作用，從而為β3?AR 在心肌梗死中的作用提供進(jìn)一步研究的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究已通過(guò)廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。（1）動(dòng)物：SD 大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF 級(jí)，雄性，體重220-240 g，實(shí)驗(yàn)期間籠養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；（2）主要試劑：BRL.37344，SR59230A 美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品：（3）實(shí)驗(yàn)儀器：PCR 儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，中國(guó)），水平電泳儀、紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，中國(guó)）。

1.2 方法 （1）動(dòng)物模型制作及分組：Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham?operated group，Sham 組，n=6）和模型組（n=12）。采用結(jié)扎左前降支（LAD）法建立大鼠心肌梗死模型［2］。飼養(yǎng)12 周后，Sham組大鼠全部存活，模型組大鼠死亡1 只。11 只大鼠再分為MI 組（n=5）和MI+BRL 組（n=6）。MI+BRL 組大鼠經(jīng)尾靜脈注射BRL?37344［0.4 nmol/（kg.min）］，每次持續(xù)10 min，每周2 次，共4 周；Sham 組及MI 組大鼠經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。術(shù)后手術(shù)組（n=30）大鼠隨機(jī)分為MI 組、MI+BRL 組、MI+SR 組。MI+BRL 組 大 鼠 予 以 尾 靜脈注射β3?AR 特異性激動(dòng)劑BRL?37344［4 nmol/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］，MI+SR 組大鼠予以尾靜脈注射β3?AR 特異性拮抗劑SR59230A［0.56 mg/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］，另外Sham 組及MI 組同時(shí)予以尾靜脈注射等量生理鹽水［4 nmol/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］。（2）采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟參數(shù)。（3）HE 染色及免疫組化：過(guò)量烏拉坦處死大鼠后，開(kāi)胸取出心臟，小心分離出左心室。左心室組織4%多聚甲醛固定24 h。取出標(biāo)本，流水沖洗15 min，切取合適大小組織塊（厚度約0.2 cm）。乙醇、二甲苯脫水和透明后，石蠟包埋并切片。標(biāo)本進(jìn)行HE 染色和鏡檢。標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，分別滴加p?p38 MAPK 一抗和二抗孵育，經(jīng)DAB 顯色和復(fù)染后，脫水、透明、封固、鏡檢。（4）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（reverse transcription?polymerase chain reac?tion，RT?PCR）：采用二步法RT?PCR 測(cè)定大鼠左心室β3?AR mRNA 表達(dá)。β3?AR（444 bp）引物設(shè)計(jì)參照既往試驗(yàn)方法［3］。引物序列：上游5′?AGT GGG ACT CCT CGT AAT G?3′，下游5?CGC TTA GCT ACG ACG AAC?3′。以β?actin（187 bp）作為內(nèi)參照，引物序列為：上游5?GAC AAC GGC TCC GGC ATG TG?3，下游5′?TGA GGA TGC CTC TCT TGC?3′。cD?NA 擴(kuò)增經(jīng)94℃3 min，40 個(gè)循環(huán)（94℃45 s，60℃45 s，72℃60 s），72℃10 min。取7 μl PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)分析、計(jì)算mRNA 表達(dá)的強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，用單因素方差分析，兩兩多重比較使用Bonferroni t 檢驗(yàn)（方差齊）或Tamhane's T2 檢驗(yàn)（方差不齊）。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

2.2 四組大鼠Masson 染色結(jié)果 與MI 組比較，MI+BRL 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化明顯減輕，MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化面積無(wú)顯著變化；MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化較MI+BRL 組明顯加重；詳見(jiàn)圖1。

表1 心肌梗死后四組大鼠心臟超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

2.3 四組大鼠TUNEL 染色結(jié)果 Sham 組比較，MI 組心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡為28.336±2.33%，大鼠心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡水平明顯加重（P＜0.05）；MI+BRL 組大鼠梗死區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡水平較MI 組顯著減輕（16.236±1.76%vs. 28.336±2.33%，P＜0.05）；MI+SR 組與MI 組未見(jiàn)明顯差別（32.436±1.37% vs. 28.336±2.33%，P＞0.05）；見(jiàn)圖1。MI+BRL 組左心室梗死面積比MI 組及MI+SR 組明顯減少（P＜0.05），且MI 組和MI+SR 組未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）；詳見(jiàn)圖2。

圖1 （電子顯微鏡×200）表示大鼠心肌梗死3 周后心肌梗死區(qū)組織纖維化Masson 圖像，其中紅色表示正常心肌細(xì)胞，藍(lán)色表示心梗后纖維化

圖2 為心肌梗死面積定量分析圖

2.4 四組大鼠梗死心肌mRNA 表達(dá)的比較 與Sham 組比較，MI 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA表達(dá)顯著增加（1.690±0.012 vs. 1.162±0.099，P＜0.05）；與MI 組比較，MI+BRL 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達(dá)進(jìn)一步增加（2.135±0.0235 vs.1.690±0.012，P＜0.05），MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達(dá)無(wú)顯著變化（1.630±0.155 vs.1.690±0.012，P＞0.05）；與MI+BRL 組比較，MI+SR組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達(dá)顯著下降（1.630±0.155 vs.2.135±0.0235，P＜0.05）；詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠β3?AR mRNA 相對(duì)表達(dá)量（2?ΔΔCT）比較

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠模型中梗死區(qū)心肌中β3?AR 表達(dá)顯著上調(diào)；激動(dòng)β3?AR 可使心肌纖維化和心肌凋亡程度減輕，提示β3?AR 可能對(duì)心肌梗死心臟有保護(hù)作用。β3?AR 參與了CHF 的心室重構(gòu)和心功能的調(diào)節(jié)［2?4］。Niu 等［8］用大鼠LAD建立MI 模型，與假手術(shù)組比較，MI 大鼠心肌β3?AR 和Gi 蛋白表達(dá)水平顯著增加。本研究結(jié)果顯示：通過(guò)結(jié)扎LAD 建立MI 模型，然后對(duì)梗死區(qū)的心肌進(jìn)行β3?AR RT?qPCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MI 后心肌β3?AR mRNA 的表達(dá)上調(diào)；且還發(fā)現(xiàn)β3?AR 激動(dòng)劑可使MI 心臟血流動(dòng)力學(xué)改善，同時(shí)MI 心肌β3?AR mRNA 表 達(dá) 量 進(jìn) 一 步 增 加，β3?AR 拮 抗劑對(duì)β3?AR mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯影響。與之相對(duì)應(yīng)的是，MI 心肌凋亡及纖維化水平較對(duì)照組升高，β3?AR 激動(dòng)劑可使MI 心肌的凋亡及纖維化程度降低，β3?AR 拮抗劑則對(duì)凋亡及纖維化水平無(wú)明顯影響，提示MI 后β3?AR 表達(dá)上調(diào)可能對(duì)梗死心肌具有保護(hù)作用。García 研究表明［9］，再灌注前給β3?AR 激動(dòng)劑BRL37344（5 μg/kg）可減少野生型小鼠在2 h 和24 h 再灌注時(shí)的梗塞面積，減少大白豬在梗死后7 d 和45 d 梗塞面積并改善了長(zhǎng)期LV 收縮功能，這種保護(hù)似乎是通過(guò)抑制心肌細(xì)胞中mPTP 的開(kāi)放的途徑實(shí)現(xiàn)。此外，阻斷β3?AR 信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)加劇心臟壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的重塑，更大的左心室擴(kuò)張，心肌肥大和纖維化增強(qiáng)，并增強(qiáng)NOS 解偶聯(lián)和隨之產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，提示β3?AR 參與了心臟重塑。

綜上所述，目前大多數(shù)研究提示β3?AR 激動(dòng)對(duì)梗死后的心臟有保護(hù)作用，然而這種心臟保護(hù)是哪一種信號(hào)傳導(dǎo)通路還需要進(jìn)一步研究明確。