黃文博，袁海榮，李秀金

（北京化工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，北京100029）

0 引言

以玉米秸為原料，通過(guò)厭氧消化技術(shù)生產(chǎn)甲烷是一種高效的可再生能源生產(chǎn)方式[1]。玉米秸的纖維素和半纖維素含量達(dá)55.0%～75.0%，具有很高的甲烷轉(zhuǎn)化潛力[2]。由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的復(fù)雜交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成的生物質(zhì)抗降解屏障具有一定的疏水作用，阻礙了厭氧微生物對(duì)纖維素和半纖維素的利用，尤其是影響水解階段纖維素酶和木聚糖酶在秸稈上的吸附和反應(yīng)[2]。為提高玉米秸的厭氧消化性能，須對(duì)其進(jìn)行改性處理。

白腐菌能通過(guò)木質(zhì)素氧化酶系統(tǒng)對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行高效降解，提高秸稈的可利用性[3]。P.ostreatus是可食用白腐菌，除了對(duì)木質(zhì)素具有高效降解性外，對(duì)纖維素和半纖維素也具有降解能力，以提供自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)。劉紅菊研究了P.ostreatus對(duì)麥秸木質(zhì)纖維素的降解效果，結(jié)果顯示，預(yù)處理10 d的麥秸木質(zhì)素含量降低43.8%，纖維素含量提高37.2%[4]。Mustafa使用P.ostreatus預(yù)處理稻草20 d，木質(zhì)素降解率為33.4%，纖維素與半纖維素的降解率分別只為7.9%和16.9%[5]。由此可見(jiàn)，P.ostreatus能夠明顯降解秸稈中的木質(zhì)素，對(duì)纖維素和半纖維素的降解程度較低，提高了它們的可利用性。以往研究表明，經(jīng)P.ostreatus改性后的木質(zhì)纖維類底物的乙醇和甲烷轉(zhuǎn)化率均有所提高。Worfa研究了不同P.ostreatus改性時(shí)間對(duì)木薯乙醇產(chǎn)率的影響，結(jié)果顯示，改性1周的木薯可發(fā)酵糖得率最高為34.1g/L，乙醇產(chǎn)率較對(duì)照組提高35.0%左右[6]。Kainthola對(duì)P.ostreatus改性5周的稻草進(jìn)行厭氧消化，甲烷產(chǎn)率提高至對(duì)照組的1.6倍[7]。

P.ostreatus的生長(zhǎng)過(guò)程分為菌絲生長(zhǎng)、原基形成和子實(shí)體分化3個(gè)階段。P.ostreatus在不同生長(zhǎng)階段中，對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力不同，因此，經(jīng)過(guò)不同P.ostreatus改性時(shí)間的玉米秸的酶水解性和甲烷產(chǎn)率也有明顯差異[8]。Worfa將P.ostreatus對(duì)木薯的改性時(shí)間由1周延長(zhǎng)至2～8周，木薯發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率降低[6]。已有研究認(rèn)為，延長(zhǎng)白腐菌改性時(shí)間，使纖維素和半纖維素的消耗增加是影響乙醇或甲烷轉(zhuǎn)化的主要原因[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，菌絲穿透可以提高秸稈的孔隙度和表面積，從而提高改性秸稈的酶吸附性和反應(yīng)性，但隨著白腐菌生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲蛋白在秸稈表面的附著又會(huì)阻礙酶對(duì)秸稈的接觸[9]。因此，須要對(duì)不同P.ostreatus改性時(shí)間的玉米秸的酶吸附、酶水解和甲烷轉(zhuǎn)化進(jìn)行多角度分析，研究各因素間的關(guān)聯(lián)性，通過(guò)機(jī)理分析，確定最佳的改性時(shí)間。

本文采用P.ostreatus對(duì)玉米秸進(jìn)行45 d改性試驗(yàn)，通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型擬合，量化改性參數(shù)，對(duì)不同改性時(shí)間的玉米秸的木質(zhì)纖維素降解、酶吸附、酶水解和甲烷轉(zhuǎn)化性能的變化進(jìn)行多視角綜合分析，探究提高玉米秸厭氧消化產(chǎn)氣性能的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌種P.ostreatus購(gòu)自黑龍江省科學(xué)院微生物研究所。玉米秸取自北京市延慶區(qū)，將其風(fēng)干粉碎至20目備用。接種物為北京順義區(qū)某中溫沼氣站消化殘余物，發(fā)酵原料為豬糞。原料和接種物基本性質(zhì)示于表1。

表1 玉米秸及接種物基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of corn stover and inoculum

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）P.ostreatus改性

將360 g（以TS計(jì)）玉米秸置于17 cm×33 cm×5 cm的聚丙烯塑料薄膜袋中；以玉米秸∶石膏=99∶1配比混合均勻；用純水調(diào)節(jié)至含水率為65%，pH值為6～7；121℃高壓蒸汽滅菌1 h。滅菌原料接種P.ostreatus，接種量（W菌種/W原料）為10%。將接種后的玉米秸置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為28℃、濕度為85%～90%條件下進(jìn)行45 d改性處理。

在45 d改性周期中，每間隔5 d取樣，測(cè)定玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的吸附性和水解性。通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析，表征改性玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的可及性和反應(yīng)性。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）厭氧消化

以不同改性時(shí)間的玉米秸為試驗(yàn)組，以未改性的玉米秸為對(duì)照組，只添加接種物為空白組，進(jìn)行甲烷潛力（BMP）測(cè)定。反應(yīng)器工作體積300 mL，頂空體積200mL（圖1）。玉米秸有機(jī)負(fù)荷為4 g/L（以VS計(jì)），接種污泥有機(jī)負(fù)荷為8 g/L（以VS計(jì)），pH為7.0±0.2。在35±2℃下厭氧消化45 d。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組均設(shè)3組重復(fù)。

圖1 甲烷潛力測(cè)定實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of BMP test device

1.3 分析方法

（1）基本性質(zhì)測(cè)定

根據(jù)APHA測(cè)定總固體含量（TS）及揮發(fā)性固體含量（VS）[10]。采用元素分析儀測(cè)定有機(jī)元素含量（TC，TH，TO及TN）。采用pH計(jì)測(cè)定pH值。采用全自動(dòng)纖維分析儀測(cè)定木質(zhì)纖維素含量。采用排水法測(cè)定厭氧消化過(guò)程產(chǎn)氣量（標(biāo)況下計(jì)算）。采用氣相色譜測(cè)定所得氣體組分含量。

（2）酶吸附性能測(cè)定

纖維素酶吸附性能的測(cè)定方法：在檸檬酸鈉緩沖溶液（0.05M，pH 4.8）中加入2.5%改性玉米秸，纖維素酶濃度為10 FPU/g，在4℃條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品以4 000 r/min離心15min，采用Bradford法測(cè)定反應(yīng)前后上清液中蛋白質(zhì)含量的變化[11]。根據(jù)公式（1）計(jì)算纖維素酶吸附率。采用相同方法測(cè)定木聚糖酶，木聚糖酶添加量為20 IU/g。

式中：A為初始酶添加量，mg；B為上清液中未吸附酶量，mg。

（3）酶水解性能分析

參照文獻(xiàn)[8]，[12]所用的方法對(duì)改性玉米秸的纖維素酶及木聚糖酶水解率進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)式（2），（3）計(jì)算酶水解率：

通過(guò)Nidetzky和Ohmine動(dòng)力學(xué)模型，分析改性玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的反應(yīng)性以及反應(yīng)速率的影響，如式（4）和（5）所示[13]。

式中：Y為不同水解時(shí)間的纖維素酶或木聚糖酶水解率，%；t為水解時(shí)間，h；P為玉米秸初始纖維素或半纖維素含量，%；K為達(dá)到最大纖維素或半纖維素水解量一半所需時(shí)間，h。

（4）厭氧消化動(dòng)力學(xué)分析

利用BMP甲烷產(chǎn)率可擬合分析一級(jí)動(dòng)力學(xué)厭氧消化產(chǎn)氣性能，擬合方程如式（6）所示[14]。

式中：BMP（t）為以VS計(jì)甲烷產(chǎn)率，mL/g；BMPmax為最大產(chǎn)甲烷潛力（以VS計(jì)），mL/g；k為以VS計(jì)的甲烷轉(zhuǎn)化速率常數(shù)，mL/（g·d）；θ為延滯期，d。

玉米秸有機(jī)組分采用概化分子式CnHaOb表示[14]。理論甲烷產(chǎn)量是當(dāng)?shù)孜锿耆D(zhuǎn)化成甲烷時(shí)的最大體積（標(biāo)況）。玉米秸的理論甲烷產(chǎn)量和生物降解性可由式（7）和式（8）得到。

式中：BD為生物降解性，%；BMP0為理論甲烷產(chǎn)率（以VS計(jì)），mL/g；BMPexp為實(shí)驗(yàn)所得甲烷產(chǎn)率（以VS計(jì)），mL/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶吸附性能的影響

圖2給出了改性玉米秸纖維素酶、木聚糖酶吸附曲線、木質(zhì)纖維素降解率及降解擬合曲線。

圖2 改性玉米秸纖維素酶、木聚糖酶吸附曲線、木質(zhì)纖維素降解率及降解擬合曲線Fig.2 Enzymes adsorption capacity，degradation ratio and liner fit for lignocellulose of the corn stovermodified by P.ostreatus

圖2（a）為不同改性時(shí)間的玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶吸附率的變化。結(jié)果顯示，改性5～25 d的玉米秸對(duì)兩種酶的吸附率隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。改性25～35 d的玉米秸對(duì)纖維素酶的吸附率仍隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，但改性35～45 d上升趨勢(shì)停止，對(duì)木聚糖酶吸附率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。經(jīng)過(guò)25 d改性后，玉米秸對(duì)纖維素酶的吸附率提高19.3%。改性45 d后，玉米秸對(duì)纖維素酶的吸附率提高42.5%。這表明P.ostreatus改性能夠明顯提高玉米秸對(duì)纖維素酶的吸附率。文獻(xiàn)[15]的研究表明，纖維素酶是通過(guò)與秸稈纖維疏水基團(tuán)結(jié)合而附著在纖維表面，木質(zhì)素和半纖維素均含有疏水基團(tuán)，能夠吸附纖維素酶，干擾纖維素對(duì)纖維素酶的吸附。因此，須要結(jié)合改性玉米秸木質(zhì)纖維素降解情況，進(jìn)一步分析改性玉米秸對(duì)纖維素酶吸附的有效性。

圖2（b）為不同改性時(shí)間下P.ostreatus對(duì)玉米秸的木質(zhì)纖維素降解率。由圖2（b）可以看出，木質(zhì)素和半纖維素降解率始終高于纖維素。玉米秸初始木質(zhì)素和半纖維素含量低于纖維素，隨著改性時(shí)間延長(zhǎng)，木質(zhì)素和半纖維素不斷減少，對(duì)纖維素酶的吸附減少，因此，纖維素對(duì)纖維素酶特異性吸附提高。改性30 d后，纖維素降解率達(dá)到20.5%，改性玉米秸的纖維素含量較低，對(duì)纖維素酶的吸附無(wú)法進(jìn)一步提高。

木聚糖是半纖維素的主要組成部分，木聚糖酶的吸附性能對(duì)半纖維素的降解效果具有主要影響。由圖2（a）可以看出，改性25 d的玉米秸對(duì)木聚糖酶吸附率提高21.0%，但改性時(shí)間超過(guò)30 d后吸附率降低了43.6%，表示部分吸附的木聚糖酶發(fā)生脫附，但殘余木聚糖酶繼續(xù)催化半纖維素水解，半纖維素降解率持續(xù)提高。

對(duì)不同階段半纖維素降解速率進(jìn)行線性擬合，如圖2（c）所示。如圖2（c）所示，改性處理30 d后，半纖維素降解速率降低，表明木聚糖酶吸附性降低對(duì)半纖維素的降解產(chǎn)生了影響。此外，Noori和Karimi研究認(rèn)為，木聚糖是維持秸稈持水性的主要物質(zhì)，而酶的吸附與秸稈持水性相關(guān)[15]。因此，隨著半纖維素的降解，木聚糖酶的吸附性也受到影響。綜上所述，改性25 d的玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的吸附效果最佳。

2.2 改性玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶水解性能的影響

酶水解性可以定量分析不同改性時(shí)間的玉米秸中纖維素和半纖維素對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的可及性和反應(yīng)性。圖3所示為改性玉米秸纖維素酶水解二級(jí)反應(yīng)模型擬合曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。圖中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1 flush，c-2 flush分別表示經(jīng)P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。

圖3 改性玉米秸纖維素酶水解二級(jí)反應(yīng)模型擬合曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.3 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of cellulase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

不同改性時(shí)間的玉米秸在不同水解時(shí)間下的纖維素酶水解率如圖3所示。由圖3（a），（c）可以看出，0～24 h改性玉米秸稈的纖維素酶水解率快速上升，120 h后水解達(dá)到平衡。對(duì)不同改性時(shí)間玉米秸的纖維素酶水解率分析結(jié)果表明，改性5～45 d的玉米秸纖維素酶水解率先上升后降低。其中，改性25 d的玉米秸纖維素酶水解率最高，較對(duì)照組提高12.9%。這可能是因?yàn)樵诟男郧?5 d，玉米秸對(duì)纖維素酶的吸附率提高明顯，促進(jìn)了對(duì)纖維素的水解。改性35～45 d的玉米秸稈對(duì)纖維素酶吸附率的提高趨于停止；在此階段玉米秸的纖維素含量相較初始含量降低了36.0%，纖維素酶可催化水解反應(yīng)的纖維素減少，導(dǎo)致最終纖維素水解率比對(duì)照組降低了2.3%。

Nidetzky纖維素酶水解模型擬合曲線如圖3（a）所示，擬合獲得的纖維素酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)P如圖3（b）所示。P值表示底物對(duì)纖維素酶的反應(yīng)性，K值表示達(dá)到最大纖維素水解率一半時(shí)的水解時(shí)間。隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米秸P值先增大后減小。改性25 d的玉米秸P值最大，為33.0%，較對(duì)照組提高18.7%，表明改性25 d的玉米秸對(duì)纖維素酶的反應(yīng)性最高。改性45 d的玉米秸P值與對(duì)照組差異不顯著（p＞0.05），表明延長(zhǎng)改性時(shí)間使玉米秸的水解性能降低。K值隨改性時(shí)間的延長(zhǎng)也呈先上升后下降趨勢(shì)，且改性玉米秸K值是對(duì)照組K值的1.9～3.3倍，表明改性玉米秸對(duì)纖維素酶的反應(yīng)速率的影響更小，水解反應(yīng)更穩(wěn)定。

圖3（c）為Ohmine纖維素酶水解模型擬合曲線，圖3（d）為擬合獲得的纖維素酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)酶水解反應(yīng)初始速率ν0和酶在秸稈上的失活速率k。結(jié)果顯示，改性5～25 d的玉米秸稈ν0低于對(duì)照組，改性30～45 d的玉米秸稈ν0與對(duì)照組相近，表明纖維素酶在改性玉米秸上的初始反應(yīng)速率降低。改性玉米秸的k值隨改性時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后增高，改性25 d的玉米秸k值最小，為0.16，表明在水解過(guò)程中，纖維素酶在改性25 d的玉米秸上失活速率最低，水解持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。

采用相同模型對(duì)木聚糖酶水解率進(jìn)行擬合的結(jié)果如圖4所示。圖4中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1flush，c-2flush分別表示經(jīng)P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。結(jié)果顯示，水解120 h后木聚糖酶水解率仍在上升，表明半纖維素水解達(dá)到平衡所需的理論時(shí)間更長(zhǎng)。改性25 d的玉米秸木聚糖酶水解率最高，較對(duì)照組提高75.3%。

圖4 改性玉米秸木聚糖酶水解二級(jí)反應(yīng)模型擬合曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.4 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of xylanase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

Nidetzky木聚糖酶水解模型擬合結(jié)果顯示，改性時(shí)間延長(zhǎng)，玉米秸的P值先增大后降低，改性30 d玉米秸P值最大，較對(duì)照組提高24%。改性玉米秸K值較對(duì)照組也有不同程度增大，改性玉米秸對(duì)木聚糖酶的水解反應(yīng)也更加穩(wěn)定。Ohmine模型擬合結(jié)果顯示，木聚糖酶在改性玉米秸上的初始反應(yīng)速率ν0低于對(duì)照組，尤其在改性時(shí)間大于30 d時(shí)，ν0明顯降低，這是由于改性玉米秸對(duì)木聚糖酶吸附率降低導(dǎo)致的。改性玉米秸k值隨改性時(shí)間延長(zhǎng)先減小后增加，改性25 d和30 d時(shí)k值最小，木聚糖酶在這兩組改性秸稈上失活速率最低，水解持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。

綜合纖維素酶和木聚糖酶的兩組模型擬合結(jié)果表明，P.ostreatus改性會(huì)降低玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的初始反應(yīng)速率，但玉米秸的反應(yīng)性提高，纖維素酶和木聚糖酶在玉米秸上的有效反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，有利于甲烷轉(zhuǎn)化，25 d是最佳改性時(shí)間。

2.3 P.ostreatus改性對(duì)玉米秸厭氧消化產(chǎn)氣性能的影響

通過(guò)BMP試驗(yàn)分析P.ostreatus改性對(duì)玉米秸厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率、甲烷轉(zhuǎn)化速率和生物降解消化性能的影響（表2）。改性25 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率最大，為272mL/g，較對(duì)照組提高16.7%。8組改性時(shí)間中，改性35 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率較對(duì)照組降低約1.3%，改性45 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率降低12.4%。通過(guò)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算初始甲烷轉(zhuǎn)化速率和生物降解性的結(jié)果顯示，改性25 d的玉米秸初始甲烷轉(zhuǎn)化速率較對(duì)照組提高19.0%，生物降解性提高19.7%。改性45 d的玉米秸甲烷轉(zhuǎn)化速率降低4.8%，生物降解性降低6.6%。由此表明，改性25 d的玉米秸厭氧消化性能最佳，改性45 d的玉米秸厭氧消化性能最差。

表2 不同改性時(shí)間玉米秸甲烷產(chǎn)率、生物降解率及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Biomethane yield，BD%and kinetic parameters of the corn stovermodified for different time

通過(guò)對(duì)改性玉米秸酶吸附、酶水解和厭氧消化性能進(jìn)行多角度分析結(jié)果表明，改性25 d后，玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶吸附率提升，進(jìn)而在酶水解過(guò)程中反應(yīng)性提高，失活率降低，酶水解效率提高。盡管酶初始反應(yīng)速率在改性25 d的玉米秸上降低，但水解過(guò)程更穩(wěn)定，促進(jìn)了玉米秸厭氧消化水解階段的正向進(jìn)行，提高了初始階段甲烷轉(zhuǎn)化速率。此外，改性25 d的玉米秸生物降解性上升，表明玉米秸可利用性提高，微生物對(duì)其中的木質(zhì)纖維素利用更充分，總甲烷產(chǎn)率提高。改性時(shí)間超過(guò)30 d時(shí)，玉米秸酶吸附和酶水解性能下降，使初始甲烷轉(zhuǎn)化速率降低。另外，此階段玉米秸的纖維素和半纖維素已被菌絲體大量消耗，生物降解性下降，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)率降低。

3 結(jié)論

P.ostreatus改性會(huì)改變玉米秸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的吸附和水解性，影響玉米秸厭氧消化甲烷產(chǎn)率。改性25 d的玉米秸纖維素酶和木聚糖酶吸附率分別提高42.5%和21.0%，纖維素酶和木聚糖酶水解率分別提高12.9%和75.3%，甲烷產(chǎn)率提高16.7%，甲烷轉(zhuǎn)化速率提高19.0%，生物降解性提高19.7%，最佳改性時(shí)間為25 d。