吳江 張曉懿 孫傳金 吉蘅山 朱虹

1 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，南京 210002；2 江蘇省常熟市第二人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 215500

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能自主地聚集到腫瘤組織的間質(zhì)，并分化為多種腫瘤間質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞，如脈管系統(tǒng)相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞等。正是由于存在這種內(nèi)在的腫瘤歸巢特性，MSCs 成為理想的腫瘤靶向遞送載體，近年來以MSCs 作為載體對腫瘤進行靶向治療已成為研究熱點[1-5]。MSCs 作為遞送載體作用非常重要，從MSCs 歸巢至腫瘤組織的時間和空間分布關(guān)系到其是否能完成靶向治療，這就需要實時、動態(tài)掌握MSCs 在體內(nèi)的運行狀態(tài)，因此分子影像示蹤MSCs 具有重要的研究意義。骨髓起源的MSCs 表面表達多種抗原，如CD90、CD73 和CD105 等[6]。本研究使用125I 標(biāo)記CD90 單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）進行體外、體內(nèi)實驗，探討125I-CD90 mAb 示蹤MSCs 的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CD90 mAb（規(guī)格：1 mg/mL）購自江蘇睿捷生物科技有限公司。Na125I 溶液（規(guī)格：100 mCi/50～100 μL）購自加拿大Mcmaster 大學(xué)。氯胺T 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，偏重亞硫酸鈉購自江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司。小鼠骨髓MSCs購自賽業(yè)生物科技有限公司，乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物研究所。Micro-SPECT/CT成像系統(tǒng)（U-SPECT/CT 型）購自荷蘭MILabs 公司，放射性核素活度計（CRC-55tR 型）購自美國Capintec 公司，γ 計數(shù)儀（GC-2016 型）購自中科中佳科學(xué)儀器有限公司，PD10 純化柱購自美國GE公司。

雌性無特定病原體級BALB/c 裸鼠20 只，4～6周齡，體重（20.0±0.8）g，由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2018-0006。飼養(yǎng)于無特定病原體級動物房，控制室內(nèi)溫度在23℃左右，相對濕度保持在40%～70%，裸鼠隨意采食全價鼠飼料及清潔水。

1.2 125I-CD90 mAb 的制備

采用氯胺T 法對CD90 mAb 進行125I 標(biāo)記。取CD90 mAb 原液50 μL，加入200 μL（0.02 mol/L）PBS（pH=7.4）和50 μL Na125I 溶液，混勻，加入20 μL氯胺T 溶液（5 mg/mL），室溫下在混勻器上反應(yīng)50 s，加入150 μL 偏重亞硫酸鈉溶液（5 mg/mL），繼續(xù)反應(yīng)5 min，用PD10 柱分離純化，洗脫液為含0.1%牛血清白蛋白的PBS（0.02 mol/L，pH=7.4），每管收集0.5 mL，觀察其顏色、透明度，測定每管放射性活度，計算標(biāo)記率，采用紙層析法對標(biāo)記產(chǎn)物進行純度鑒定。

1.3 體外細(xì)胞結(jié)合實驗

計數(shù)MSCs 并調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×104個/mL，使用1.5 mL 的離心管，根據(jù)設(shè)定的不同的時間點（10 min、30 min、1 h、2 h、6 h 和8 h）分為6 組，每組6 個復(fù)孔，共36 個離心管。每管加入100 μL的MSCs 懸 浮 液，然 后 加 入3.7×103Bq/2 μL 的125I-CD90 mAb，每隔15 min 搖晃一下。于每個時間點2500×g離心5 min，取上清液，加入1 mL的PBS，再離心取上清液，然后加入500 μL 的PBS，吹起沉淀細(xì)胞。將所有上清液存于放免管中，記為上清液管（F），將吹起的沉淀細(xì)胞存于另一個放免管中，記為細(xì)胞管（B），用γ 計數(shù)儀分別檢測上清液管（F）和細(xì)胞管（B）的放射性計數(shù)，根據(jù)公式B/（B+F）×100%，計算125I-CD90 mAb 與MSCs 的細(xì)胞結(jié)合率。將乳腺癌MCF-7 細(xì)胞作為對照，按上述同樣的步驟進行實驗并計算125I-CD90 mAb 分別與MCF-7、MSCs 的細(xì)胞結(jié)合率。

1.4 荷瘤裸鼠Micro-SPECT/CT 顯像

將乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株進行常規(guī)培養(yǎng)擴增，在接種前1 天換新鮮培養(yǎng)基，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS 洗2 次，加入1 mL 含乙二胺四乙酸的0.25%胰酶進行消化，輕拍培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，然后加入完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min，將細(xì)胞（1×107個/mL）重懸于無血清培養(yǎng)基中。于BALB/c 裸鼠的右側(cè)腋下接種乳腺癌MCF-7 細(xì)胞0.1 mL，待腫瘤長至150～200 mm3時用于實驗。采用完全隨機法將荷瘤裸鼠分為a、b、c、d 組，每組3 只荷瘤裸鼠，a 組經(jīng)腹腔注射MSCs（1×106個/0.3 mL）；b 組經(jīng)腹腔注射相同體積的生理鹽水；c 組經(jīng)瘤內(nèi)注射MSCs（數(shù)量、體積同a 組），d 組經(jīng)瘤內(nèi)注射相同體積的生理鹽水，然后每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射125I-CD90 mAb（3.7 MBq/0.2 mL），分別于6 h、1 d、2 d、3 d后進行Micro-SPECT/CT 顯像，參數(shù)：矩陣129×129、能峰30 keV、窗寬60%、準(zhǔn)直器針孔2.0 mm、重建分辨率＜ 0.9 mm、靈敏度＞ 13 000 cps/MBq、電壓55 kV、電流615 mA，層厚0.8 mm。采集方式為靜態(tài)10 min SPECT、中分辨率全身CT，通過儀器自帶PMOD 軟件測定并計算腫瘤及主要器官和組織的放射性攝取值[每克組織百分注射劑量率（percentage activity of injection dose per gram of tissue, %ID/g）]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組均數(shù)之間的比較采用獨立樣本t檢驗（方差齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 125I-CD90 mAb 的制備

合成的125I-CD90 mAb 溶液無色、透明，標(biāo)記率為54.4%，放射化學(xué)純度為98.79%。

2.2 體外細(xì)胞的結(jié)合

細(xì)胞結(jié)合實驗結(jié)果如圖1 所示，在10、30 min和1、2、6、8 h 時，125I-CD90 mAb 與MSCs 的結(jié)合率分別為0.86%、1.73%、1.88%、5.67%、12.20%、10.69%，從10 min 到6 h，其結(jié)合率逐漸上升，6 h時達到高峰，之后下降。作為對照，125I-CD90 mAb與乳腺癌MCF-7 細(xì)胞在上述6 個時間點的結(jié)合率分別為0.30%、0.39%、0.78%、1.34%、1.90%、2.06%。由此可見，125I-CD90 mAb 與MSCs 在各個時間點的結(jié)合率都明顯高于與乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的結(jié)合率。

圖 1 125I-CD90 mAb 與MSCs、乳腺癌MCF-7 細(xì)胞在不同時間點的細(xì)胞結(jié)合率 mAb 為單克隆抗體；MSCs 為間充質(zhì)干細(xì)胞Figure 1 The binding ratios of 125I-CD90 monoclonal antibody in mesenchymal stem cells and breast cancer MCF-7 cells at different times

2.3 Micro-SPECT/CT 顯像

由圖2 可見，Micro-SPECT/CT 顯像結(jié)果顯示，125I-CD90 mAb 在荷瘤BALB/c 裸鼠的腫瘤及主要器官和組織有著不同程度的分布。a 組的125I-CD90 mAb 分布多于b 組，c 組的125I-CD90 mAb 分布也多于d 組（圖3）。由圖4 可見，在注射后6 h、1 d、2 d、3 d 時，a 組腫瘤組織的放射性攝取值分別為（3.66±1.69）、（2.35±1.30）、（1.36±0.95）、（1.33±0.84）%ID/g，均高于b 組的（2.93±1.74）、（1.92±1.15）、（1.12±0.78）、（1.03±0.72）%ID/g，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.52、0.43、0.35、0.47，均P＞0.05）；c 組腫瘤組織的放射性攝取值分別為（5.75±1.30）、（3.75±0.77）、（2.70±0.44）、（1.88±0.48）%ID/g，均高于d 組的（3.17±0.75）、（2.03±0.54）、（1.44±0.39）、（1.38±0.27）%ID/g，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.98、3.19、3.70、1.59，均P＜0.05）。

3 討論

圖 2 4 組荷瘤BALB/c 裸鼠注射后不同時間點 125I-CD90 單克隆抗體的生物學(xué)分布 %ID/g 為每克組織百分注射劑量率Figure 2 125I-CD90 mocolonal antibody biodistribution in four groups of tumor-bearing BALB/c mice after injection in different times

近年來，一些基于生物基質(zhì)的遞送載體因其獨特的仿生特性受到越來越多的關(guān)注，例如RBC、淋巴細(xì)胞和MSCs 等，這些天然載體的仿生態(tài)特征增加了機體的認(rèn)同度，避免了被機體清除，有利于提高遞送效率[7]。MSCs 是一種能自我更新的多能干細(xì)胞，最初從骨髓分離出來，脂肪、肌肉等其他組織也含有一定的數(shù)量[8]。Zischek 等[9]利用MSCs靶向遞送基因藥物至胰腺癌間質(zhì)，有效地抑制了胰腺癌的生長。Cao 等[10]使用MSCs 遞送載有光敏劑的介孔二氧化硅，實施光動力治療明顯抑制了乳腺癌的生長。這些研究結(jié)果表明，MSCs 具有腫瘤歸巢特性，是理想的腫瘤靶向遞送載體。

圖 3 125I-CD90 mAb 注射后6 h 4 組荷瘤BALB/c 裸鼠的SPECT/CT 圖 A 為腹腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞組；B 為腹腔注射生理鹽水組；C 為瘤內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞組；D 為瘤內(nèi)注射生理鹽水組，各圖中箭頭所示為腫瘤組織的125I-CD90 mAb 分布。mAb 為單克隆抗體；SPECT/CT 為單光子發(fā)射計算機體層攝影術(shù)Figure 3 SPECT/CT images of 125I-CD90 monoclonal antibody in four groups of tumor-bearing BALB/c mice at 6 h after injection

圖 4 4 組荷瘤BALB/c 裸鼠注射后不同時間點的腫瘤組織放射性攝取值 a 組為腹腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞；b 組為腹腔注射生理鹽水；c 組為瘤內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞；d 組為瘤內(nèi)注射生理鹽水。 %ID/g 為每克組織百分注射劑量率Figure 4 Tumor radioactive uptake values in four groups of tumor-bearing BALB/c mice at different times after injection

然而，利用MSCs 靶向遞送仍然需要解決MSCs 的示蹤問題，示蹤MSCs 可以掌握其進入體內(nèi)多長時間歸巢到腫瘤組織、在腫瘤組織的聚集什么時候達到最大量、在腫瘤組織中的分布情況等。近年來，非侵襲性的分子影像MRI、SPECT和PET 等在示蹤干細(xì)胞方面取得了一些進展，其中核醫(yī)學(xué)分子影像以其獨特的優(yōu)勢成為示蹤MSCs的首選[11-13]。然而，目前示蹤MSCs 使用較多的99Tcm、18F 和64Cu 等核素的半衰期都相對較短，鑒于MSCs 在歸巢過程中可能會耗時較長，基于這些核素的分子影像不足以示蹤作為遞送載體的MSCs。放射性核素125I 半衰期長，較容易獲得，且發(fā)射γ 射線可用于SPECT 顯像，此外，放射性碘標(biāo)記抗體方法成熟，容易實現(xiàn)。因此，本研究使用125I 標(biāo)記CD90 mAb 作為MSCs 的分子影像探針不僅具有一定的創(chuàng)新性，而且理論和實踐均可行。

125I 標(biāo)記的CD90 抗體主要通過結(jié)合MSCs 表面的CD90 抗原以識別MSCs。本研究的體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明，125I-CD90 mAb 能與MSCs 結(jié)合，且兩者的結(jié)合率隨孵育時間逐漸上升，至孵育6 h時達到高峰，體現(xiàn)了這種結(jié)合具有時間依賴性，也表明了兩者在體外的最佳結(jié)合時間點為6 h 左右，從而為后續(xù)的體內(nèi)實驗確定了最佳時間點。此外，本研究還開展了125I-CD90 mAb 與乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的體外結(jié)合實驗作為對照，結(jié)果表明，125I-CD90 mAb 與MSCs 的結(jié)合率明顯高于與乳腺癌MCF-7細(xì)胞的結(jié)合率，證實了125I-CD90 mAb 與MSCs 體外特異性結(jié)合的優(yōu)勢，也為后續(xù)開展體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。

基于乳腺癌荷瘤裸鼠的Micro-SPECT/CT 顯像結(jié)果表明，125I-CD90 mAb 在體內(nèi)有著不同程度的分布，尤以脾臟的放射性分布最高，這與以往核素標(biāo)記抗體在體內(nèi)分布結(jié)果相似，表明脾內(nèi)的單核吞噬系統(tǒng)對抗體的捕獲。然而，本研究還發(fā)現(xiàn)125I-CD90 mAb 在荷瘤裸鼠的前后爪也有較高的放射性分布，這在以往的動物實驗中是未曾見的。由于實驗組和對照組的荷瘤裸鼠均存在這種現(xiàn)象，這種分布可能與MSCs 不相關(guān)；由于131I 不會在小鼠爪部聚集，據(jù)此類推，同為放射性碘的125I 也不會聚集在小鼠爪部。由此推測，荷瘤裸鼠爪部的放射性分布很可能與CD90 抗體有關(guān)，這種分布有可能是非特異性的，需要通過后續(xù)的實驗進一步研究這種分布機制。

125I-CD90 mAb 在荷瘤裸鼠腫瘤組織的分布結(jié)果顯示，瘤內(nèi)注射MSCs 組高于瘤內(nèi)注射生理鹽水組，腹腔注射MSCs 組也高于腹腔注射生理鹽水組，且后者在4 個不同時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。前者表明，瘤內(nèi)注射的MSCs 能結(jié)合腫瘤血管輸送的125I-CD90 mAb，使更多的125I-CD90 mAb 聚集在腫瘤組織，從而證實了125I-CD90 mAb 與MSCs在體內(nèi)的特異性結(jié)合。后者表明，腹腔注射的MSCs 通過歸巢效應(yīng)聚集到腫瘤組織，也能結(jié)合腫瘤血管中的125I-CD90 mAb，使125I-CD90 mAb 較多地滯留在腫瘤組織，這不僅證實了MSCs 的腫瘤歸巢特性，也從另一方面證實了MSCs 與125I-CD90 mAb 在體內(nèi)存在特異性結(jié)合。

本研究在進行荷瘤BALB/c 裸鼠經(jīng)尾靜脈注射MSCs 實驗時，部分荷瘤裸鼠死亡，因此未能按計劃開展相應(yīng)的125I-CD90 mAb 體內(nèi)結(jié)合MSCs 實驗，這是本研究的不足之處。死亡的原因可能是MSCs 注射量較多，堵塞了荷瘤裸鼠的肺毛細(xì)血管。今后的研究需進一步優(yōu)化MSCs 經(jīng)尾靜脈注射實驗方案，進行更高水平的125I-CD90 mAb 示蹤MSCs 腫瘤歸巢實驗。

綜上，本研究成功制備了125I-CD90 mAb，并經(jīng)體外和體內(nèi)實驗證實其可特異性結(jié)合MSCs，有望成為示蹤MSCs 的分子影像探針。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明吳江負(fù)責(zé)研究過程的實施、數(shù)據(jù)的分析、論文的起草及最終版本的修訂；張曉懿負(fù)責(zé)研究過程的實施、數(shù)據(jù)的獲取與分析；孫傳金負(fù)責(zé)研究方案的修訂；吉蘅山負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的分析；朱虹負(fù)責(zé)研究命題的提出與設(shè)計、論文的審閱與修訂。