陳銀花 覃章輝 沈永琴 鐘克 王明紅

莼菜（Brasenia schreberiJ.F.Gmel.），是莼菜科（Cabombaceae）莼屬（Brasenia）多年水生草本植物[1]，是藥食兩用的珍稀水生蔬菜，已被中國(guó)列入國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄[1，2]。目前對(duì)莼菜的研究主要在栽培管理技術(shù)[3，4]、莼 菜 多 糖 提 取[5～7]、莼菜群落[8]和品種資源遺傳多樣性[9]等幾個(gè)方面，關(guān)于不同生態(tài)型莼菜植株對(duì)環(huán)境因子的生理響應(yīng)研究較少。

植物都有較適生長(zhǎng)溫度范圍，超出這個(gè)范圍，會(huì)發(fā)生溫度脅迫（高溫、低溫），造成生長(zhǎng)不良或死亡。持續(xù)高溫或低溫脅迫會(huì)破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧物質(zhì)，丙二醛（MDA）含量增加，嚴(yán)重影響植株正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[10，11]。有研究表明，植物在高、低溫脅迫下葉片內(nèi)可溶性蛋白含量顯著增加，以減輕逆境傷害[12]；可溶性蛋白質(zhì)總量與各品系對(duì)高溫的耐性呈正相關(guān)，耐性強(qiáng)的品系含量高[13]。此外，高溫或低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)超氧化物歧酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等保護(hù)酶活性發(fā)生變化，活性變化幅度與植物抗逆性密切相關(guān)[14，15]。 保護(hù)酶活性及MDA含量可作為植物受到溫度脅迫程度和植物對(duì)溫度脅迫抵御能力的衡量指標(biāo)[16]。前期研究結(jié)果表明，莼菜有夏季休眠期和冬季休眠期[17]，休眠時(shí)間長(zhǎng)。因此，研究溫度脅迫對(duì)不同生態(tài)型莼菜植株葉片的生理影響，為篩選抗寒或耐熱莼菜品種和打破莼菜休眠提供理論依據(jù)，對(duì)莼菜種質(zhì)資源的保護(hù)以及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有指導(dǎo)意義。

圖1 3類(lèi)莼菜葉片樣品

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用莼菜葉片于2018年11月10日（莼菜休眠期）采自湖北利川繼昌莼菜基地（30°10'5''N，108°48'22''E；海拔1 100 m左右）。材料來(lái)自同一試驗(yàn)田地，已連作5 a，以每年冬季莼菜爛葉作為自給肥料。樣品包括2種生態(tài)型：冬季休眠生態(tài)型（DL和WB）和冬季非休眠生態(tài)型（ND）。DL是莼菜植株功能葉，隨冬季溫度的持續(xù)降低將全部腐爛壞死；WB是莼菜植株在越冬過(guò)程中形成的休眠芽葉片，在持續(xù)低溫環(huán)境下葉片仍然長(zhǎng)勢(shì)良好；ND是頂端卷曲小葉能正常展開(kāi)、功能葉長(zhǎng)勢(shì)良好，并且冬季不會(huì)進(jìn)入休眠的莼菜植株葉片。3類(lèi)葉片，如圖1所示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取長(zhǎng)勢(shì)基本一致且都帶有完整健康浮葉的莼菜植株，先用純水將其附帶的雜質(zhì)清洗干凈，再用種植盆（外口徑21 cm，高12 cm）以水培的形式培養(yǎng)，置于LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱（每天12 h光照/12 h黑暗交替，PPFD=121 μmol·m-2·s-1）中，分別進(jìn)行低溫（5°C）和高溫（35°C）處理，每組處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15株，以0、2、4、6 d為取樣時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)溫度同一時(shí)間點(diǎn)取3株幼苗，每株取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的功能葉片測(cè)定其生理生化指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

可溶性蛋白提取參照宋松泉等[18]的方法，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[19]；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定[20]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參照宋松泉等[18]的方法；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定參照孫兵[21]、孫祥生[22]的方法；過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定參照孫兵[21]、Rao等[23]的方法；過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定使用愈創(chuàng)木酚法[21]；多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定使用鄰苯二酚法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

文中所有數(shù)值均表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，用one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢測(cè)進(jìn)行多重比較（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片生理指標(biāo)的影響

①可溶性蛋白含量的變化 隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，休眠生態(tài)型植株體內(nèi)可溶性蛋白含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，DL體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量呈顯著下降的趨勢(shì)，葉片在第5天全部腐爛，WB的可溶性蛋白含量則呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)（P＜0.05）；非休眠生態(tài)型植株（ND）在高溫脅迫下呈先降后升的變化趨勢(shì)（P＜0.05，表1）。

②MDA含量的變化 高溫脅迫下DL的MDA含量顯著高于ND和WB。其隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，休眠生態(tài)型植株（DL和WB）的MDA含量呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)（P＜0.05），非休眠生態(tài)型植株的ND的MDA含量則呈現(xiàn)“降—升—降”的變化趨勢(shì)（P＜0.05，表2）。

③高溫脅迫對(duì)莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性的影響 高溫脅迫下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，DL、ND和WB的SOD活性均呈顯著下降的變化趨勢(shì)（P＜0.05），但DL的SOD活性遠(yuǎn)高于ND和WB；DL的POD活性隨高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降后升的變化趨勢(shì)（DL在第5天全部腐爛），WB和ND的POD活性呈現(xiàn)“降—升—降”的變化趨勢(shì)（P＜0.05）；DL的CAT活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著上升的變化趨勢(shì)（DL在第5天全部腐爛，P＜0.05），WB的CAT活性在高溫下脅迫2 d時(shí)呈顯著下降（P＜0.05），隨后隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升（P＜0.05），ND的CAT活性則無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；DL和WB的APX活性隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而ND的APX活性呈顯著上升變化趨勢(shì)（P＜0.05）；DL和ND的PPO活性呈顯著上升的變化趨勢(shì)（P＜0.05），WB的PPO活性則無(wú)顯著性變化（P＞0.05，表3）。

表1 高溫脅迫下莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片可溶性蛋白含量（mg/g）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

表2 高溫脅迫下莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片MDA含量（nmol/mg）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.2 低溫脅迫對(duì)莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片生理指標(biāo)的影響

①可溶性蛋白含量的變化 低溫脅迫下，3種莼菜葉片的可溶性蛋白含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)，其中冬季休眠生態(tài)型植株（WB）的可溶性蛋白含量呈顯著上升的變化趨勢(shì)（P＜0.05，表4）。

②MDA含量的變化 在低溫（5℃）下，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，冬季休眠生態(tài)型植株（DL）的MDA含量呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），且均顯著高于ND和WB的MDA含量。而ND和WB的MDA含量并無(wú)顯著性變化（P＞0.05，表5）。

③低溫脅迫對(duì)莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性的影響 隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，DL的SOD活性呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)（P＜0.05），ND的SOD活 性 呈 持 續(xù) 下 降的變化趨勢(shì)（P＜0.05），而WB的SOD活性則無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；ND和WB的POD活性在低溫脅迫2 d時(shí)均顯著增加，隨后顯著下降（P＜0.05），DL的POD活性則與之相反，呈先降后升的變化趨勢(shì)（P＜0.05）；DL、WB和ND的CAT活性均呈顯著上升變化趨勢(shì)（P＜0.05）；DL和WB的APX活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)（P＜0.05），ND的APX活性則呈顯著上升的變化趨勢(shì)（P＜0.05）；ND的PPO活性呈先升后降的變化趨勢(shì)（P＜0.05），而DL和WB的PPO活性則無(wú)顯著性變化（P＞0.05，表6）。

表3 高溫脅迫下休眠和非休眠生態(tài)型葉片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)逆境的響應(yīng)與其體內(nèi)可溶性蛋白含量的變化存在相關(guān)性[24]，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的積累可作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而有利于植物抗寒[25]。本研究中，非休眠生態(tài)型植株（ND）和休眠生態(tài)型植株（DL、WB）在低溫脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)含量整體呈上升趨勢(shì)；高溫脅迫下，DL的可溶性蛋白含量隨脅迫時(shí)間的增加呈顯著下降的趨勢(shì)，這可能是由于溫度過(guò)高阻礙了DL植株葉片蛋白質(zhì)的正常合成，而且植株自身為抵抗逆境其蛋白質(zhì)會(huì)降解，植物自身保護(hù)酶系統(tǒng)也會(huì)消耗，導(dǎo)致蛋白含量降低。這是DL葉片在高溫脅迫5 d后全部腐爛，而ND和WB植株葉片仍然長(zhǎng)勢(shì)較好的原因。

表4 低溫脅迫下莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片可溶性蛋白含量（mg/g）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

表5 低溫脅迫下莼菜休眠和非休眠生態(tài)型葉片MDA含量（nmol/mg）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

MDA含量是反映植物細(xì)胞受傷害程度以及對(duì)逆境的響應(yīng)[26]，耐性強(qiáng)的品種MDA含量較低[27]。植物利用抗氧化酶加強(qiáng)抗氧化作用抑制活性氧的積累，防止自由基的毒害，提高抗性，隨著逆境脅迫的增加，酶活性一般呈上升趨勢(shì)，或者呈先上升后下降的趨勢(shì)[28，29]。本研究中，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，DL中的CAT活性顯著上升，MDA含量顯著下降，SOD和POD活性在脅迫2 d后也顯著增加，這說(shuō)明SOD、POD和CAT能在一定程度上清除了DL中因溫度脅迫產(chǎn)生的過(guò)量活性氧物質(zhì)，減輕植物的膜脂過(guò)氧化傷害；而莼菜葉片中APX活性一直較低，并無(wú)明顯相關(guān)性，這可能是由于APX在DL受低溫脅迫期間只是起著信號(hào)傳導(dǎo)作用。綜合分析可知，ND和WB較DL有較強(qiáng)的低溫耐性，ND和WB或?yàn)檩徊硕緩?fù)壯的理想材料。

高溫脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，DL、ND和WB中的SOD、POD活性最終呈下降趨勢(shì)；DL的CAT活性在高溫脅迫前期顯著增加，2 d后其活性并無(wú)顯著性變化，這說(shuō)明對(duì)高溫脅迫最先做出響應(yīng)的是SOD。此時(shí)莼菜休眠生態(tài)型植株葉片（DL）中MDA含量呈現(xiàn)先緩慢降低隨后升高的趨勢(shì)，均高于ND和WB 2種生態(tài)型植株葉片，這又說(shuō)明高溫脅迫下DL內(nèi)MDA含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加與保護(hù)酶活性的降低有關(guān)。然而隨高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，ND的CAT活性無(wú)顯著性變化，其PPO活性呈顯著上升的變化趨勢(shì)，這似乎表明ND在高溫脅迫中，通過(guò)PPO來(lái)抑制體內(nèi)的活性氧物質(zhì)，從而對(duì)高溫具有一定的耐性，這與Siddika等[30]的研究結(jié)果相似。

表6 低溫脅迫下休眠和非休眠生態(tài)型葉片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

綜上推測(cè)，非休眠生態(tài)型植株（ND）和冬季休眠生態(tài)型的冬芽（WB）對(duì)低溫和高溫均具有較強(qiáng)的耐性，或可作為莼菜復(fù)壯的理想材料。