黎展華 周繼紅 陳斯寧 潘玲 馮原 羅美群 李瑞祥 王浩舟 劉劍

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530021）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率居首位的惡性腫瘤，全世界的年發(fā)病人數(shù)約為123萬［1‐2］。其中85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）。目前對NSCLC的主要治療手段為手術(shù)、物理療法、放療和化療，但總體治療效果差強人意，因此開發(fā)出安全高效的肺癌治療藥物乃是當(dāng)前肺癌研究的熱點之一［3‐4］。

天然來源的小分子白藜蘆醇（resveratrol）具有結(jié)構(gòu)簡單、毒性小等特點，可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，已被證實具有較為肯定的抗腫瘤作用，但具體的作用機制尚未完全闡明［5］。

microRNA在腫瘤中的作用類似于癌基因或抑癌基因，通過調(diào)節(jié)多個靶基因影響多種信號通路，調(diào)節(jié)一系列腫瘤細(xì)胞的功能如增殖、凋亡、侵襲和分化［6‐7］。在我們的前期研究中，microRNA506（miR‐506）在肺癌細(xì)胞及肺癌組織中表達(dá)明顯減少［8］。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）是一種高度保守的脂酶，是調(diào)控神經(jīng)酰胺/1‐磷酸鞘氨醇的限速酶。SPHK1作為一個致癌激酶在多種癌癥中被顯著上調(diào)，它與癌癥的發(fā)展和侵襲密切相關(guān)［9‐10］。在我們的前期研究中，qRT‐PCR、免疫印跡和熒光素酶報告基因的結(jié)果表明SPHK1是miR‐506的一個直接靶點；通過作用于SPHK1，miR‐506的上調(diào)可以抑制NSCLC的細(xì)胞增殖、侵襲，并且促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡［8］。

本研究通過探討白藜蘆醇對人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）增殖、周期、凋亡的影響以及白藜蘆醇對miR‐506、SPHK1的影響，進(jìn)一步探索白藜蘆醇抑制NSCLC的作用機制，為白藜蘆醇在NSCLC治療方面提供新的思路與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌A549細(xì)胞（貨號：NA）購自上海細(xì)胞庫。白藜蘆醇（分子質(zhì)量228 g/mol，純度＞99.99%，貨號：501‐36‐0）購自上海麥克林公司。DMEMH培養(yǎng)基（貨號：12100046）、胎牛血清（貨號：10270‐106）購自美國Gibco公司。QuantiNova SYBR（貨號：208054）購自德國QIAGEN公司。CCK‐8試劑盒（貨號：CK04）購自上海Dojindo公司。hsa‐miR‐506‐3p inhibitor購 自 吉 瑪 基 因。Green PCR Kit（500T，貨號：D7268M）購自上海碧云天公司。First strand cDNA synthesis kit（貨號：K1622）購自美國Thermo公司。FITC Annexin V（貨號：556547）購自美國BD Biosciences公 司。HRP‐Conjugated GAPDH Antibody（貨號：HRP‐60004）、HRP‐Conjugated Beta Actin Antibody（貨號：HRP‐60008）購自美國Potein-tech公司。Anti‐Mouse IgG（Fc specific）‐Peroxidase antibody produced in goat（貨號：A2554‐1ml）購自美國Sigma公司。Anti‐rabbit IgG、HRP‐linked Antibody#7074（貨號：7074S）購自美國CST公司。Anti‐SPHK1 antibody（貨號：Ab71700）購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEMH培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組培養(yǎng)及藥物干預(yù)

1.2.2.1 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實驗將A549細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中分為以下各組（白藜蘆醇干預(yù)24 h和48 h兩個時間點）：①空白對照組：A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；②白藜蘆醇30μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為30μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；③白藜蘆醇50μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為50μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；④白藜蘆醇100μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h。

1.2.2.2 miR‐506、SPHK1實驗根據(jù)說明書使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor至A549細(xì)胞，然后將A549細(xì)胞接種于6孔板中并分為以下各組（白藜蘆醇干預(yù)24 h和48 h兩個時間點）：①空白對照組：A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；②A549細(xì)胞（miR‐506‐inhibi-tor）組：轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；③白藜蘆醇30 μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì)胞（miR‐506‐inhibitor）使用濃度為30μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；④白藜蘆醇50μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì) 胞（miR‐506‐inhibi-tor）使用濃度為50 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；⑤白 藜蘆醇100 μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì) 胞（miR‐506‐inhibitor）使 用 濃 度 為100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h。

1.2.3 CCK‐8法檢測A549細(xì)胞增殖按CCK‐8實驗說明書操作，細(xì)胞分別孵育24 h、48 h后加入CCK‐8顯色液，于培養(yǎng)箱中孵育100 min后細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中讀取各孔450 nm處吸光度值。每個時間段設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞周期收集各組細(xì)胞，使用70%的甲醇固定，離心，洗滌細(xì)胞后加入500μl PI/RNase染料孵育后，使用流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，根據(jù)實驗說明書使用Annexin V‐FITC和PI雙標(biāo)記免疫熒光染色，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長488 nm，用一波長為515 nm的熒光通道檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的熒光通道檢測PI值，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 qRT‐PCR檢 測A549細(xì) 胞miR‐506及SPHK1 miR‐506引 物 序 列：上 游5'‐TATTCAG-GAAGGTGTTACTTAA‐3'，下 游5'‐CGCAGGGTCC-GAGGTATTC‐3'。SPHK1引 物 序 列：上 游5'‐GC-GCTTCACTCTGGGCACCTTCC‐3'，下游5'‐GTCCTC-GTCGGGCACCACTGTCC‐3'。miR‐506的內(nèi)參U6引物序列：上游5'‐CTCGCTTCGGCAGCACA‐3'，下游5'‐AACGCTTCACGAATTTGCGT‐3'。SPHK1的內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5'‐CAAATTCCATGGCACC-GTCA‐3'，下游5'‐GACTCCACGACGTACTCAGC‐3'。收集各組細(xì)胞，根據(jù)說明書裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.7 Western blot檢測A549細(xì)胞SPHK1收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，按照使用說明書提取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，煮沸使蛋白變性，按照凝膠試劑說明書及檢測指標(biāo)的分子量大小，配置相應(yīng)濃度的蛋白膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，按照抗體說明書推薦的稀釋比，稀釋相應(yīng)抗體，SPHK1一抗室溫?fù)u床孵育2 h，HRP標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值計算，蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗。檢驗水平以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖CCK‐8實驗結(jié)果顯示：各白藜蘆醇干預(yù)組對A549細(xì)胞的增殖均有抑制作用，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并且白藜蘆醇對A549細(xì)胞的增殖作用和白藜蘆醇的藥物濃度及干預(yù)時間密切相關(guān)。其中30 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h對A549細(xì)胞的抑制作用最弱，100 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)48 h對A549細(xì)胞的抑制作用最明顯。見圖1。

2.2 白藜蘆醇對A549細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示與對照組相比，白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后使大部分細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0‐G1階段，少部分細(xì)胞停滯在G2‐M階段和S階段，并且白藜蘆醇對A549細(xì)胞周期的影響在48 h更明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖的抑制率Fig.1 Inhibition rate of A549 cultivated with resveratrol

2.3 白藜蘆醇對A549細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：各白藜蘆醇干預(yù)組均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞48 h組凋亡的細(xì)胞數(shù)量最多，呈現(xiàn)濃度時間依賴性。見圖3。

2.4 白藜蘆醇對A549細(xì)胞miR‐506表達(dá)的影響qRT‐PCR法檢測A549細(xì)胞miR‐506表達(dá)情況，結(jié)果顯示：白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，使A549細(xì)胞中的miR‐506表達(dá)明顯上調(diào)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞24 h時間點，100μmol/L濃度組上調(diào)miR‐506的表達(dá)量最多；白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞48 h時間點，30μmol/L濃度組上調(diào)miR‐506的表達(dá)量最多。miR‐506‐in-hibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后使miR‐506的表達(dá)量下降，使用白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞后，miR‐506表達(dá)量明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對A549細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of resveratrol on A549 cell cycle tested by flow cytometry

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of resveratrol on A549 cell apoptosis tested by flow cytometry

2.5 白藜蘆醇對A549細(xì)胞SPHK1 mRNA表達(dá)的影響qRT‐PCR法檢測A549細(xì)胞SPHK1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，可以使SPHK1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染組，沉默miR‐506使SPHK1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后能夠使SPHK1 mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6、7。

圖4 qRT‐PCR檢測白藜蘆醇對A549細(xì)胞miR‐506的影響Fig.4 Effect of resveratrol on miR‐506 in A549 cells de-tected by qRT‐PCR

圖5 qRT‐PCR檢測白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞miR‐506的影響Fig.5 Effect of resveratrol on miR‐506‐inhibitor trans-fected A549 cells detected by qRT‐PCR

圖6 qRT‐PCR檢測白藜蘆醇對A549細(xì)胞SPHK1 mRNA的影響Fig.6 Effect of resveratrol on SPHK1 mRNA expression in A549 cells by qRT‐PCR

2.6 白藜蘆醇對A549細(xì)胞SPHK1蛋白表達(dá)的影響Western blot法檢測A549細(xì)胞SPHK1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，SPHK1蛋白表達(dá)水平降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染組，沉默miR‐506后SPHK1蛋白表達(dá)與對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。但白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐in-hibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠使SPHK1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8、9。

圖7 qRT‐PCR檢測白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞SPHK1 mRNA的影響Fig.7 Effect of resveratrol on mRNA expression of SPHK1 in A549 cells transfected with miR‐506‐in-hibitor by qRT‐PCR

圖8 Western blot檢測白藜蘆醇對A549細(xì)胞SPHK1蛋白的影響Fig.8 Effect of resveratrol on SPHK1 protein in A549 cells by Western blot

圖9 Western blot檢測白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞SPHK1的蛋白的影響Fig.9 Effect of resveratrol on expression of SPHK1 pro-tein in A549 cells transfected with miR‐506‐inhibi-tor by Western blot

3 討論

已有研究表明，白藜蘆醇可以抑制人類宮頸癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生長且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［11‐14］。YU等［15］的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過抑制miR‐520‐h‐PP2A/C‐Akt‐NF‐B‐grade FOXC2通路從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。另一項研究中，BAE等［16］通過miRNA表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后能使71個miRNAs的表達(dá)量增加，并且這些miRNAs直接影響肺癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡。

在我們的前期研究中，miR‐506的表達(dá)量在NSCLC中明顯減少［8］。上調(diào)miR‐506可以有效抑制NSCLC的增殖及侵襲，MMP‐9和MMP‐2的表達(dá)也明顯被抑制［8］。此外，還發(fā)現(xiàn)SPHK1是miR‐506的一個直接靶點，通過作用于SPHK1，miR‐506的上調(diào)可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲，并且促進(jìn)NSCLC的凋亡［8］。

目前白藜蘆醇治療NSCLC的機制尚未完全闡明，我們的實驗首先證實了白藜蘆醇能夠抑制A549細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并且白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡具有濃度和時間依賴性。白藜蘆醇干預(yù)后大部分A549細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0‐G1階段。qRT‐PCR結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)組均能使A549細(xì)胞的miR‐506表達(dá)量上調(diào)；使用miR‐506‐shRNA轉(zhuǎn)染沉默miR‐506后，白藜蘆醇亦能明顯提高miR‐506的表達(dá)；總的來說白藜蘆醇能有效提高miR‐506的表達(dá)量。TIAN等［17］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過調(diào)控SPHK1/（sphingosine‐1‐phosphate，S1P）通路和神經(jīng)酰胺表達(dá)量從而抑制白血病細(xì)胞株K562的增殖及誘導(dǎo)其凋亡。我們通過qRT‐PCR及Western blot實驗檢測A549細(xì)胞的SPHK1，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后SPHK1，mRNA表達(dá)量較對照組明顯減少，白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后SPHK1蛋白表達(dá)量亦較對照組明顯減少，該實驗結(jié)果和TIAN等［12］的研究結(jié)果一致；并且使用miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染沉默miR‐506后白藜 蘆 醇 干 預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn) 染 組SPHK1的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯下降，大體上說明白藜蘆醇可以抑制A549細(xì)胞的SPHK1表達(dá)。結(jié)果表明白藜蘆醇可能通過調(diào)控miR‐506和SPHK1從而抑制A549細(xì)胞的增殖且促進(jìn)其凋亡。

LI等［18］的 研 究 表 明 上 調(diào)miR‐506可 能 通 過SPHK1/Akt/NF‐κB通路抑制胰腺癌的進(jìn)展且降低其耐藥性，提示在胰腺癌中SPHK1是miR‐506的調(diào)控靶點。我們的前期研究與其他研究均表明，上調(diào)miR‐506可以通過作用于SPHK1逆轉(zhuǎn)NSCLC和胰腺癌的增殖且促進(jìn)其凋亡［8，18］。在本研究中白藜蘆醇可以抑制A549細(xì)胞的增殖同時誘導(dǎo)其凋亡，此外白藜蘆醇可以上調(diào)miR‐506和降低SPHK1的表達(dá)水平，因此我們認(rèn)為白藜蘆醇可以通過靶向調(diào)控miR‐506/SPHK1從而有效抑制NSCLC。

綜上所述，白藜蘆醇可以抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上述作用的強弱與白藜蘆醇的藥物濃度及白藜蘆醇的作用時間密切相關(guān)；通過進(jìn)一步的機制研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過提高miR‐506的表達(dá)從而抑制SPHK1的表達(dá)進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖且誘導(dǎo)其凋亡。miR‐506/SPHK1信號通路可能是白藜蘆醇發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一，為白藜蘆醇的抗腫瘤治療提供新的理論依據(jù)。