彭勝男 陶琰心洪婷 楊海燕 黃青（江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，南昌 330004）

IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）又稱Berger病，是最為常見的原發(fā)性腎小球疾病。文獻(xiàn)報(bào)道，與健康志愿者相比，IgAN患者血清IL‐10水平較高，血清可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白（growth stimulation expressed gene 2 protein，sST2）濃度與IL‐10水平、24 h尿蛋白和血清IgA水平呈正相關(guān)［1］。治療后血清sST2水平顯著降低，血清IL‐10水平顯著升高。故推測(cè)sST2和IL‐10參與IgAN發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)，IgAN大鼠p70S6K磷酸化水平較對(duì)照組顯著上調(diào)，雷帕霉素可有效抑制p70S6K磷酸化，低劑量mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制IgA沉積，減少蛋白尿、系膜細(xì)胞激活及細(xì)胞外基質(zhì)分泌，保護(hù)腎功能［2］。故推測(cè)Akt/mTOR/p70S6k通路在IgAN中被激活。

依據(jù)國(guó)際共識(shí)對(duì)IgAN的定義，IgAN的診斷標(biāo)準(zhǔn)是免疫熒光檢查可見腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，以此證明造模成功［3］。亞洲地區(qū)IgAN發(fā)病率高達(dá)30%～40%，常會(huì)發(fā)展為終末期腎臟?。?］。目前IgAN的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究認(rèn)為IgAN患者常伴有胃腸道感染或上呼吸道感染，外源性致病抗原穿過黏膜屏障作用于黏膜細(xì)胞或B細(xì)胞，導(dǎo)致IgA1分子絞鏈區(qū)O‐聚糖半乳糖缺失，導(dǎo)致其糖基化異常，異常糖基化的IgA1分子刺激機(jī)體產(chǎn)生大量IgG和IgA抗體，在血清中形成IgA1免疫復(fù)合物，最后沉積于腎小球系膜區(qū)導(dǎo)致腎臟損傷。因此，減少異常IgA1生成是IgAN治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。mTOR與B細(xì)胞分化密切相關(guān)。結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物1（tuberous sclerosis complex‐1，TSC1）是mTOR上游的負(fù)性調(diào)控因子，敲除小鼠B細(xì)胞中的TSC1可導(dǎo)致B細(xì)胞成熟障礙。Akt激活時(shí)其邊緣區(qū)B細(xì)胞明顯減少，而mTOR抑制劑雷帕霉素可部分緩解邊緣區(qū)B細(xì)胞減少，證明mTOR與B細(xì)胞增殖密切相關(guān)［5］。LPS可作為免疫佐劑，破壞肝臟的內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)，減少IgA清除。目前，IgAN的治療方式主要有糖皮質(zhì)激素、抗感染、抗凝、免疫抑制劑、扁桃體摘除術(shù)、血漿置換、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等，但效果較差［6］。IgAN患者扁桃體內(nèi)含有異常糖基化的IgA1，因此臨床常采取扁桃體摘除術(shù)治療IgAN，減少異常IgA1產(chǎn)生，減輕免疫炎癥反應(yīng)，恢復(fù)機(jī)體免疫平衡。黃芪治療IgAN已有報(bào)道，黃芪顆粒聯(lián)合厄貝沙坦治療IgAN可有效調(diào)節(jié)免疫力，減少感染，降低蛋白尿水平，提高臨床療效［7］。黃芪甲苷（astragalosideⅣ，AS）是黃芪的重要藥理成分，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可減少異常IgA生成，抑制免疫炎癥因子產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。本研究探討AS對(duì)IgAN大鼠脾淋巴細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28只清潔級(jí)SD大鼠，體重（200±20）g，購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1.1.2 主要試劑AS購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Roche公司；脂多糖（LPS）購(gòu)自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、蓖麻油購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；RAPA購(gòu)自上海源葉生物科技公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的IgA抗體和IL‐10抗體購(gòu)自Abcam公司；CD4抗體和p‐p70S6k抗體購(gòu)自Cell signaling公司；CD8抗體購(gòu)自Biolegend公司；p‐mTOR抗體購(gòu)自Thermo Fisher公司；IgG二抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、IgAN模型組、RAPA組和AS組，每組7只。采用BSA+LPS+CCl4聯(lián)合構(gòu)建IgAN大鼠模型，第1～6周隔天灌胃給予BSA（400 mg/kg），第6周和第8周末尾靜脈注射LPS（0.05 mg/只），第1～9周每周末皮下注射CCl4（CCl40.1 ml/只+蓖麻油0.5 ml/只）。RAPA組SD大鼠造模第7周灌胃給予RAPA 1 mg/（kg·d），1次/d，連續(xù)4周，其余同IgAN組。AS組大鼠建模過程中灌胃給予AS，前6周采用1%AS混懸液配制BSA，其他操作與IgAN組相同，第7周開始灌胃給予AS 50 mg/（kg·d），1次/d，連續(xù)4周，對(duì)照組除給予等量生理鹽水，其他操作與IgAN組相同。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)喂食，第10周股動(dòng)脈取血，快速取脾臟和腎臟，脾臟用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化和病理觀察。腎皮質(zhì)在置于冰上，迅速制成冰凍切片，用于免疫熒光觀察。

1.2.2 腎組織免疫熒光觀察取腎皮質(zhì)制成8μm冰凍切片，丙酮固定10 min，PBS洗3次，5 min/次，加入正常山羊血清，37℃孵育45 min，甩干，勿洗，滴加FITC標(biāo)記的IgA抗體（1∶100），避光操作，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，晾干，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 脾組織病理觀察取脾臟用4%多聚甲醛固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片（5μm），HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠脾臟病理學(xué)變化。

1.2.4 脾CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD8+T細(xì)胞數(shù)檢測(cè)各組切片脫蠟，水化，微波修復(fù)抗原，滴加去離子水，再分別滴加CD4和CD8一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察并拍照，方網(wǎng)測(cè)試系統(tǒng)計(jì)數(shù)，并計(jì)算CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)密度。

1.2.5 脾臟ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)切片脫蠟，水化，抗原修復(fù)，分別滴加IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k抗體，4℃孵育過夜，PBS清洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。高倍鏡觀察并拍照。采用Image‐Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算各視野陽(yáng)性染色的積分光密度（IOD）并計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎ⅠgA沉積對(duì)照組大鼠腎小球系膜區(qū)未見明顯綠色熒光，IgAN組大鼠腎小球系膜區(qū)可見較強(qiáng)綠色熒光，提示造模成功。與IgAN組比，RAPA組和AS組大鼠腎小球系膜區(qū)綠色熒光強(qiáng)度減弱（圖1），提示RAPA和AS可減輕IgAN大鼠炎癥反應(yīng)，減少腎小球系膜區(qū)IgA沉積，可能與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞有關(guān)，此兩類細(xì)胞均可高表達(dá)IgA可結(jié)晶片段受體（FcαR），前者可介導(dǎo)急性炎癥，后者可介導(dǎo)慢性炎癥。

2.2 大鼠脾臟病理學(xué)變化對(duì)照組大鼠脾組織結(jié)構(gòu)清晰，白髓區(qū)內(nèi)脾小體較小而少，主要為B淋巴細(xì)胞，一側(cè)以中央動(dòng)脈為中心，周圍淋巴組織呈鞘狀包繞，主要為T淋巴細(xì)胞。與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠白髓區(qū)內(nèi)脾小體體積增大。數(shù)量增多，生發(fā)中心更為明顯，小結(jié)帽朝向邊緣區(qū)，提示B淋巴細(xì)胞進(jìn)一步增殖，一側(cè)動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚，T淋巴細(xì)胞數(shù)增多，提示IgAN大鼠脾內(nèi)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答均增強(qiáng)。與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾小體增大增多和動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚情況減輕，提示RAPA和AS均可抑制IgAN大鼠脾內(nèi)免疫應(yīng)答，減輕免疫炎癥反應(yīng)（圖2）。

圖1 大鼠腎臟IgA免疫熒光染色（×400）Fig.1 IgA immunofluorescence staining of kidneys of rats（×400）

圖2 大鼠脾臟病理學(xué)檢查（×400）Fig.2 Pathological examination of spleen in rats

2.3 大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫組化檢測(cè)與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)密度增加而CD8+T細(xì)胞數(shù)密度減少（P＜0.01）。與IgAN組比，RAPA組 和AS組大 鼠 脾內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)密度均減少而CD8+T細(xì)胞數(shù)密度增加（P＜0.05）。提示IgAN大鼠脾內(nèi)輔助性T細(xì)胞（Th）增多而抑制性T細(xì)胞（Ts）減少，免疫系統(tǒng)過度激活，AS和RAPA均可有效糾正免疫失衡，抑制免疫系統(tǒng)過度激活（表1、圖3）。

表1 大鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)密度（±s，1×104個(gè)/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

表1 大鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)密度（±s，1×104個(gè)/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.05.

CD8+T 1.01±0.12 0.64±0.131）0.92±0.111）2）0.96±0.251）2）Groups Control IgAN RAPA AS CD4+T 2.20±0.23 7.20±1.901）5.31±1.631）2）4.60±1.571）2）

圖3 大鼠脾臟CD4、CD8 T細(xì)胞免疫組化染色（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining of CD4，CD8 T cells in spleens of rats（×400）

圖4 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR、p‐p70S6k免疫組化染色（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining of IL‐10，p‐mTOR，p‐p70S6k in spleens of rats（×400）

表2 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

表2 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.01.

p‐p70S6k（×103）46.69±25.89 65.11±32.431）22.17±11.841）2）40.10±24.062）Groups Control IgAN RAPA AS IL‐10（×103）10.02±4.97 4.94±2.261）6.33±1.771）2）7.10±2.121）2）p‐mTOR（×103）13.06±7.48 19.96±8.031）9.26±2.961）2）8.90±2.711）2）

2.4 大鼠脾臟ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k免疫組化檢測(cè)與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾臟內(nèi)IL‐10水平下降（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平升高（P＜0.01）。與IgAN組比，RAPA組和AS組大鼠脾臟內(nèi)IL‐10水平升高（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平下降（P＜0.01）。提示IgAN大鼠脾臟內(nèi)免疫抑制因子IL‐10分泌減少，p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)上調(diào)，mTORC1信號(hào)通路被激活。RAPA組和AS組大鼠脾臟內(nèi)IL‐10分泌增多，且p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)降低，mTORC1信號(hào)通路被抑制（圖4、表2）。

3 討論

IgAN是世界最常見的一種原發(fā)性腎小球腎炎，主要以腎小球系膜區(qū)IgA免疫復(fù)合物沉積為病理學(xué)特點(diǎn)［8］。本實(shí)驗(yàn)選用BSA+LPS+CCL4三聯(lián)法造模，實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組大鼠腎臟系膜區(qū)未見明顯IgA沉積，而IgAN組大鼠腎臟系膜區(qū)出現(xiàn)不連續(xù)的顆粒狀I(lǐng)gA沉積，提示造模成功。與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠腎小球系膜區(qū)綠色熒光不同程度減弱，提示RAPA和AS均可減輕腎小球系膜區(qū)IgA沉積。

IgAN是一種自身免疫性疾病，引起IgAN的自身抗原主要是異常糖基化的IgA1，其形成可能與扁桃體炎、上呼吸道和胃腸道感染等黏膜免疫反應(yīng)有關(guān)，在患者血清和腎小球系膜區(qū)均可檢測(cè)到較高濃度的異常IgA1［9］。IgAN的發(fā)生與多種因素相關(guān)，如機(jī)體免疫失調(diào)、黏膜免疫異常、IgA分子結(jié)構(gòu)異常、IgA免疫復(fù)合物清除障礙、遺傳因素等，但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確?？梢钥隙ǖ氖?，IgA免疫復(fù)合物的大量產(chǎn)生和在腎小球系膜區(qū)沉積是發(fā)病關(guān)鍵。抑制過度免疫應(yīng)答、減少IgA產(chǎn)生和在腎小球系膜區(qū)沉積、維持機(jī)體免疫平衡是治療IgAN的重要思路。本研究HE染色切片觀察到，與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾臟白髓中脾小體增大增多，生發(fā)中心明顯，動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾小體增大增多和動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚情況減輕，提示在IgAN發(fā)病中，大鼠脾臟內(nèi)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)。血液中IgA主要由骨髓中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，分泌型IgA主要是由胃腸道和呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生。本研究考慮IgA主要由B細(xì)胞激活后分泌，而脾臟是B細(xì)胞的主要定居地及免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所，結(jié)合病理觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾臟白髓中脾小體增大增多，生發(fā)中心明顯（脾小體內(nèi)主要為B細(xì)胞），推測(cè)IgAN中大量產(chǎn)生的IgA與脾臟B細(xì)胞增殖有關(guān)，RAPA和AS可抑制免疫激活，減輕免疫應(yīng)答。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Breg）在2006年首次被發(fā)現(xiàn)，是B細(xì)胞的亞群，主要通過分泌IL‐10及TGF‐β等免疫抑制因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［10］。分泌IL‐10的Breg是目前研究熱點(diǎn)，其可抑制小鼠過敏反應(yīng)和部分自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、接觸性過敏反應(yīng)、哮喘、自身免疫性腦脊髓炎等［11］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾內(nèi)IL‐10分泌減少，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內(nèi)IL‐10分泌增多，提示免疫抑制因子IL‐10分泌減少，免疫應(yīng)答過度激活，可能是引起IgAN發(fā)病的重要原因，分泌IL‐10的調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞是IgAN發(fā)病的關(guān)鍵。RAPA和AS可促進(jìn)IL‐10分泌，抑制過度免疫應(yīng)答，可能是導(dǎo)致其腎小球系膜區(qū)IgA沉積減少的原因之一。同時(shí)，本研究顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組大鼠脾內(nèi)CD4+T細(xì)胞增加而CD8+T細(xì)胞減少，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內(nèi)CD4+T細(xì)胞減少而CD8+T細(xì)胞增加，提示在IgAN大鼠脾內(nèi)Th增多而Ts減少，發(fā)生免疫系統(tǒng)過度激活，AS和RAPA均可有效糾正這種免疫失衡，抑制免疫系統(tǒng)過度激活，進(jìn)一步說明調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞對(duì)IgAN發(fā)病起重要作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）在炎癥性自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，在IgAN中的作用前言中也有報(bào)道［12］。mTOR信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)Breg、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分化具有重要作用，mTOR分為mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）2種，mTORC1對(duì)RAPA及其衍生物敏感，雷帕霉素可抑制淋巴細(xì)胞增殖，mTOR與淋巴細(xì)胞分化成熟密切相關(guān)［13‐15］。ZHANG等［16］構(gòu)建了含有mTOR亞等位基因的小鼠模型，下調(diào)mTORC1和mTORC2活性及mTOR蛋白表達(dá)，小鼠前體B細(xì)胞早期發(fā)育被部分阻斷，外周B淋巴細(xì)胞數(shù)明顯減少。在B細(xì)胞受體（BCR）介導(dǎo)的B細(xì)胞激活中，無論是RAPA還是磷脂酰肌醇‐3‐激酶（PI3K）抑制劑均可阻斷B淋巴細(xì)胞增殖，提示PI3K及下游mTOR直接影響B(tài)CR通路［17］。mTORC1信號(hào)被激活后，作用于轉(zhuǎn)錄因子核糖體蛋白激酶（p70S6k）和4E‐結(jié)合蛋白1（4E‐BP1），其磷酸化程度是反映mTORC1活性的重要指標(biāo)，在下游蛋白翻譯過程中起關(guān)鍵作用。p70S6k被mTORC1激活后可促進(jìn)mRNA翻譯。本研究顯示，IgAN大鼠脾內(nèi)p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)上升，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內(nèi)p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)降低，提示在IgAN發(fā)病過程中，mTORC1信號(hào)通路被激活，而RAPA和AS可抑制mTORC1信號(hào)通路激活?；趯?duì)BCR增殖作用的影響，抑制mTORC1通路、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和分化、抑制免疫炎癥反應(yīng)有望成為自身免疫性疾病治療的有效方法。

AS是從中藥黃芪中提取的中藥單體，是黃芪的主要藥理成分之一，可減少M(fèi)CP‐1、TNF‐α和TGF‐β等炎癥細(xì)胞因子分泌，減輕免疫炎癥反應(yīng)。利用免疫抑制劑治療IgAN已取得一定療效［18］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AS可有效地減少IgAN大鼠脾臟CD20+B細(xì)胞數(shù)，具體途徑可能是AS通過抑制促炎癥因子高遷移率族蛋白1（high mobility group pro-tein 1，HMFB1）抑制炎癥反應(yīng)，而HMFB1可通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）影響B(tài)細(xì)胞分化和增殖，糾正免疫失衡。本研究顯示，與IgAN組相比，AS組大鼠脾內(nèi)p‐mTOR和p‐p70S6k表達(dá)降低，mTORC1信號(hào)通路被抑制。RAPA可抑制B淋巴細(xì)胞增殖，mTOR與B淋巴細(xì)胞的分化成熟密切相關(guān)，推測(cè)AS可能通過抑制mTORC1通路減少脾臟內(nèi)效應(yīng)性B細(xì)胞數(shù)，從而減少IgA產(chǎn)生，減輕免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，AS可減輕IgAN大鼠腎小球系膜區(qū)IgA沉積，可能與抑制mTORC1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞分化和增殖有關(guān)，是否有其他信號(hào)通路參與有待進(jìn)一步研究。