周婷婷 陳先勇 陳桂婷 曹楠 李世剛（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨與骨破壞為特征的慢性自身免疫性疾病，全球發(fā)病率為0.5%～1.0%，女性發(fā)病率是男性的2～4倍［1］。RA作為高致殘性慢性疾病，嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量，具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。

肥大細(xì)胞（mast cell，MC）及其相關(guān)細(xì)胞因子在RA發(fā)病機(jī)制中的作用是近年研究熱點(diǎn)，研究表明，正常關(guān)節(jié)中活化的MC約占正常關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞總數(shù)的1%～5%，但RA患者滑膜中活化的MC數(shù)明顯增多，是正常水平的6～25倍，且增加程度與病情活動(dòng)度相關(guān)，滑膜MC常聚集于血管翳和軟骨交接及血管翳侵入骨皮質(zhì)處，通過多種途徑引發(fā)RA，導(dǎo)致軟骨和骨損害［2］。

資木瓜是鄂西南道地藥材，具有補(bǔ)肝益腎、舒筋活絡(luò)、抗炎止痛等作用，主治濕痹拘攣，腰膝關(guān)節(jié)疼痛，常用于風(fēng)濕、RA治療［3］。資木瓜總苷（total sa-ponins ofchaenomeles speciosa，TSCS）是資木瓜主要有效成分。本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠，通過給予KitW‐4Bao小鼠過繼移植正常小鼠的骨髓來源肥大細(xì)胞（BMMC），探討TSCS通過抑制MC活化治療K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制［4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KRN小鼠，8周齡，雄性，由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Mathis D.和Benoist C.教授饋贈(zèng)。SPF級(jí)NOD/Lt J小鼠，8周齡，雌性，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2014‐0004。SPF級(jí)C57BL/6小鼠，8周齡，雌性，購(gòu)于湖北省疾控中心，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（鄂）2015‐0018。KitW‐4Bao小鼠，8周齡，雌性，購(gòu)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（浙）2011‐0048。

1.1.2 藥品與試劑D101大孔吸附樹脂分離純化TSCS，含量為51%，臨用時(shí)采用雙蒸水配成所需濃度，pH=7.4；小鼠IgG、IL‐6、IL‐17、TPS（Tryptase）、TNF‐α和PGE2ELISA試劑盒（Elabscience公司）；Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；Anti‐Mast Cell Trypt-ase和Anti‐PAR‐2（Abcam公司）；Trizol Reagent（Invit-roge公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建雄性KRN小鼠與雌性NOD小鼠雜交生產(chǎn)的F1代小鼠即為K/B×N小鼠。采用心臟采血法，離心收集2～6月齡K/B×N小鼠血清。8～12周齡的C57BL/6小鼠和KitW‐4Bao小鼠及移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠，在第0、3天分別尾靜脈注射150μl K/B×N小鼠血清，構(gòu)建K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.2 分組及給藥方案C57BL/6小鼠分別注射C57BL/6小鼠血清及K/B×N小鼠血清作為正常對(duì)照組和模型組，KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清作為陰性對(duì)照組，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠隨機(jī)分為3組：陽(yáng)性藥物組、低、高劑量藥物組，均注射K/B×N小鼠血清，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均構(gòu)建K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎模型。致炎第4天開始給藥，1次/d，共17 d，正常對(duì)照組、模型組和陰性對(duì)照組給予等體積生理鹽水，低、高劑量藥物組分別灌胃給予60、240 mg/kg TSCS，陽(yáng)性藥物組腹腔注射25 mg/kg色甘酸鈉，于第20天處死小鼠，取血樣和關(guān)節(jié)組織。

1.2.3 關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評(píng)分致炎前、致炎后第4、8、12、16、20天，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠足踝關(guān)節(jié)厚度，根據(jù)足踝關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無紅腫；1分：1個(gè)足踝關(guān)節(jié)紅腫；2分：2個(gè)足踝關(guān)節(jié)紅腫；3分：3個(gè)足踝關(guān)節(jié)紅腫；4分：4個(gè)足踝關(guān)節(jié)紅腫。

1.2.4 關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀察關(guān)節(jié)組織固定脫鈣，常規(guī)石蠟包埋制片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。根據(jù)關(guān)節(jié)周圍組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（炎癥）程度、邊緣帶血管翳（血管翳）、骨侵蝕及軟骨破壞情況進(jìn)行評(píng)分［5］。

1.2.5 滑膜組織MC及脫顆粒觀察石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，甲苯胺藍(lán)（TB）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察MC形態(tài)并計(jì)數(shù)。脫顆粒率（%）=脫顆粒MC數(shù)/MC總數(shù)×100%。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)滑膜組織Tryptase、PAR‐2表達(dá)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，3%H2O2處理滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA室溫封閉30 min，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，孵育1 h，DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，封片，顯微圖像分析系統(tǒng)定量分析圖像。

1.2.7 血清抗體及關(guān)節(jié)組織炎癥因子檢測(cè)采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IgG及關(guān)節(jié)組織Tryptase、TNF‐α、IL‐6、IL‐17、PGE2含量變化。

1.2.8 qRT‐PCR檢 測(cè) 關(guān) 節(jié) 組 織Tryptase、PAR‐2 mRNA表達(dá)取液氮凍存小鼠炎癥足跖關(guān)節(jié)制備組織勻漿，提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)Tryptase、PAR‐2 mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評(píng)分與陰性對(duì)照組相比，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清后出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀。與模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯降低（P＜0.05），TSCS低劑量組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

2.2 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理變化及評(píng)分HE染色結(jié)果如圖2所示，與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠關(guān)節(jié)間隙消失，滑膜中有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有骨及軟骨破壞；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關(guān)節(jié)間隙清晰，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，骨及軟骨破壞程度明顯減輕；TSCS低劑量組小鼠關(guān)節(jié)間隙減小，滑膜中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、骨及軟骨的破壞程度均較WT模型組有所降低。各組病理學(xué)評(píng)分分析發(fā)現(xiàn)，與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠各項(xiàng)評(píng)分升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組各項(xiàng)評(píng)分均顯著降低（P＜0.01），而TSCS低劑量組各項(xiàng)評(píng)分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

圖1 各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評(píng)分Fig.1 Joint swelling degrees and arthritis scores of mice in each group

圖2 各組小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色（×200）Fig.2 HE staining of joint tissue of mice in each group（×200）

2.3 各組小鼠關(guān)節(jié)組織肥大細(xì)胞脫顆粒變化TB染色結(jié)果見圖4，與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠關(guān)節(jié)組織MC脫顆粒數(shù)較多，脫顆粒率較高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關(guān)節(jié)組織MC脫顆粒數(shù)顯著減少，脫顆粒率降低（P＜0.01），TSCS低劑量組小鼠關(guān)節(jié)組織MC脫顆粒率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分Fig.3 Histopathological scores of joints of mice in each group

圖4 各組小鼠關(guān)節(jié)MC脫顆粒情況（×100）Fig.4 Degranulation of joint MC of mice in each group（×100）

圖5 各組小鼠關(guān)節(jié)組織Tryptase表達(dá)（×200）Fig.5 Expression of Tryptase mRNA in joint tissues of mice in each group（×200）

圖6 各組小鼠關(guān)節(jié)組織PAR‐2表達(dá)（×200）Fig.6 Expression of PAR‐2 in joint tissues of mice in each group（×200）

2.4 各組小鼠關(guān)節(jié)組織Tryptase蛋白和mRNA表達(dá)與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠關(guān)節(jié)組織Tryptase蛋白及mRNA表達(dá)升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組Tryptase蛋白及mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），TSCS低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

2.5 各組小鼠關(guān)節(jié)組織PAR‐2蛋白和mRNA表達(dá)與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠關(guān)節(jié)組織PAR‐2蛋白及mRNA表達(dá)升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠PAR‐2蛋白及mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），TSCS低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖7 各組小鼠血清IgG及關(guān)節(jié)組織炎癥因子水平Fig.7 Levels of serum IgG and joint tissue inflammatory factors of mice in each group

2.6 各組小鼠血清ⅠgG及關(guān)節(jié)組織炎癥因子水平與W‐4Bao陰性對(duì)照組相比，WT模型組小鼠血清中IgG、關(guān)節(jié)組織Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含 量升高；與WT模型組相 比，TCSC高 劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠血清中IgG、關(guān)節(jié)組織Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含量顯著降低（P＜0.05），TSCS低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

3 討論

K/B×N小鼠關(guān)節(jié)炎模型作為最常用的基因修飾小鼠模型之一，是RA研究的重要工具。該模型與RA的臨床組織學(xué)特征相似，均有白細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜炎、血管翳生成、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞等特征，且發(fā)病嚴(yán)重、迅速，在遺傳背景相同的動(dòng)物中發(fā)病率為100%［6］。K/B×N小鼠來自KRN‐T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠與NOD小鼠雜交F1代，在4～5周齡自發(fā)產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，將K/B×N小鼠血清注射到正常小鼠如BALB/c、C57BL/6小鼠體內(nèi)，可在較短時(shí)間內(nèi)誘發(fā)關(guān)節(jié)炎［7］。因此，本研究采用K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎模型研究TSCS治療RA的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)MC與多種自身免疫性疾病的發(fā)生聯(lián)系密切［8‐9］。RIVELLESE等［10］分析MC在治療早期RA患者滑膜中的存在以及其與滑膜炎組織學(xué)特征的關(guān)聯(lián)和功能關(guān)系發(fā)現(xiàn)，早期RA患者滑膜MC數(shù)較高，且與局部和全身炎癥、自身抗體陽(yáng)性率和較高的疾病活動(dòng)度有關(guān)，提示MC參與RA發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)，MC通過自身抗體IgG/FcγR介導(dǎo)的活化可產(chǎn)生大量炎癥因子，如IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、組胺和Tryptase等，且以脫顆粒方式釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎［11］。Tryptase是MC的特異性標(biāo)志物，在胞內(nèi)含量最多，其在MC中的儲(chǔ)存和表達(dá)具有高度選擇性，可作為MC激活及脫顆粒的標(biāo)志物［12］。

滑膜組織的主要組成細(xì)胞是成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast‐like synoviocytes，F(xiàn)LS），F(xiàn)LS凋亡減少與RA滑膜增生密切相關(guān)［13］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LS對(duì)Fas凋亡途徑高度敏感［14］。盡管凋亡因子Fas在RA滑膜組織中高表達(dá)，F(xiàn)LS仍然高度增殖，提示RA滑膜組織中存在抑制FLS凋亡的機(jī)制［15］。研究發(fā)現(xiàn)，MC脫顆粒釋放的Tryptase在抑制FLS凋亡的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，Tryptase通過與表達(dá)于FLS細(xì)胞膜上的PAR‐2相互作用，激活PAR‐2偶聯(lián)的G蛋白R(shí)ho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制FLS凋亡［16‐17］。同時(shí)，F(xiàn)LS釋放干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stem cell factor，SCF），通過與表達(dá)在MC上的SCF受體C‐kit結(jié)合，維持MC增殖活化，共同構(gòu)成MC‐FLS雙信號(hào)自身放大系統(tǒng)，促進(jìn)RA發(fā)生發(fā)展［18］。因此，MC的持續(xù)活化可能是抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖、引起關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵，提示抑制MC活化有望成為RA治療的途徑［19］。

課題組前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSCS可顯著抑制不同抗原刺激的MC活化脫顆粒［20］。Tryptase可通過與表達(dá)在FLS胞膜上的PAR‐2相互作用，進(jìn)而激活PAR‐2偶聯(lián)的G蛋白R(shí)ho信號(hào)，抑制FLS凋亡，給予PAR‐2拮抗劑處理后可顯著降低Tryptase對(duì)FLS的抗凋亡作用［16］。

本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠以及過繼移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探究TSCS對(duì)K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎的治療作用，結(jié)果表明，MC參與K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程，TSCS可明顯降低關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、病理學(xué)評(píng)分、滑膜組織MC脫顆粒率、滑膜組織Tryptase和PAR‐2蛋白和mRNA、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、血清IgG表達(dá)，對(duì)K/B×N小鼠血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，其機(jī)制可能與TSCS抑制MC活化脫顆粒釋放Tryptase，進(jìn)而影響MC‐Tryptase‐PAR‐2‐FLS途 徑，抑 制 滑 膜FLS增殖有關(guān)，與課題組前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，為以MC為靶點(diǎn)的新型抗RA藥物的研發(fā)提供依據(jù)。