于寧 宋囡 王瑩 楊關(guān)林 賈連群（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

近年來，心血管疾病患病率與死亡率仍處于逐年上升階段，死亡率居首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，已成為重大的公共衛(wèi)生問題，防治心血管疾病刻不容緩［1］。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclero-sis，AS）為心血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為大、中動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜增厚隆起，中膜平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致管腔狹窄至閉塞［2］。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（cholesterol reverse transport，RCT）為改善AS脂質(zhì)沉積的主要機(jī)制，是指作為受體的高密度脂蛋白將泡沫細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等肝外組織細(xì)胞中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行分解代謝，合成分泌膽汁，通過腸道排出體外的過程，是正常機(jī)體維持脂代謝平衡的重要機(jī)制之一［3］。PPARγ/LXRα/ABCA1信號(hào)通路是參與RCT的經(jīng)典通路之一。流行病學(xué)研究顯示，HDL‐C與心血管事件呈負(fù)相關(guān)，HDL‐C濃度每升高1 mg/dl，冠心病的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)降低2%～3%［4］。HDL參與RCT，發(fā)揮抗氧化、抗炎功能。但在慢性炎癥、血脂異常、糖尿病、AS等病理?xiàng)l件下，HDL的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生改變，導(dǎo)致功能異常，即成為dyHDL，dyHDL可阻礙RCT過程［5］。研究表明，茯苓多糖具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、防治肝損傷、心腦血管疾病的作用［6］。本研究以dyHDL與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)為切入點(diǎn)，探討茯苓多糖作為藥物干預(yù)是否能夠通過改善dyHDL并促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)PPARγ/LXRα/ABCA1信號(hào)通路防治AS，為AS防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物32只SPF級(jí)ApoE‐/‐小鼠，6～8周齡，體重20～22 g，同齡遺傳背景相同的C57BL/6J小鼠10只，所有動(dòng)物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012‐0001，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度（22±5）℃，濕度（50±2）%。

1.1.2 藥物及試劑茯苓多糖（索萊寶，批號(hào)A6520）；辛伐他?。ê贾葜扑幱邢薰局菽硸|，批號(hào)J20180007）；ABCA1抗 體（Immunoway，批 號(hào)YN2847）；PPARγ抗體、LXRα抗體（proteintech，批號(hào)分別為16643‐1‐AP、14351‐1‐AP）；β‐actin抗體（康為試劑，批號(hào)CW0096）；CYP7A1抗體、SR‐B1抗體（博奧森，批號(hào)分別為bs‐2399R、bs‐1186R）；小鼠SAA ELISA試劑盒、小鼠S1P ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為ml001976、ml062988）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器7500 Real‐time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；梯度PCR儀（美國ABI，veriti 96 well Thermal Cycler）；全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝，TBA‐120FR）；濕轉(zhuǎn)印電泳槽、垂直電泳槽（美國Bio‐Rad）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模與給藥全部ApoE‐/‐小鼠，給予高脂飼料喂養(yǎng)，8周后抽取2只，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠主動(dòng)脈斑塊是否已形成作為判斷造模成功與否的標(biāo)志。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為模型組、茯苓多糖組、辛伐他汀組，每組10只。10只C57BL/6J小鼠作為正常組。正常及模型組給予生理鹽水，茯苓多糖組給予茯苓多糖，按0.2 g/（kg·d），0.5 ml/次，灌胃，給藥4周。正常組喂養(yǎng)普通飼料，模型組、茯苓多糖組、辛伐他汀組喂養(yǎng)高脂飼料。

1.2.2 血脂檢測采用10%水合氯醛麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈取血，將血液放入促凝管中放置2 h后，2 500 r/min，離心20 min，將上清吸于1.5 ml EP管中，-80℃保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測TG、TC、HDL‐C、LDL‐C含量。

1.2.3 HE、油紅O染色法檢測肝臟脂質(zhì)沉積情況HE染色：將小鼠肝臟置于4%多聚甲醛中，梯度脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，用HE染色，洗滌10 min，95%乙醇脫水2次，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察肝臟病理組織學(xué)形態(tài)。

油紅O染色：將放置于4%多聚甲醛中的肝臟取出，包埋，制備厚度為8～10μm的冰凍切片，油紅O染色10 min，75%酒精分化2 s，水洗1 min，蘇木素復(fù)染2 min，自來水洗滌。1%鹽酸酒精分化并水洗，氨水藍(lán)水洗后甘油明膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。

1.2.4 ELⅠSA法檢測小鼠血清SAA、S1P含量將小鼠血清吸取于1.5 ml的EP管中，設(shè)計(jì)排版，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入樣品稀釋液40μl、樣品10μl，依次進(jìn)行加酶、溫育、洗滌、顯色，最后加終止液，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測定每孔吸光度。

1.2.5 Real time RT‐PCR法檢測小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1mRNA表達(dá)稱取小鼠肝臟100 mg，RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟RNA，去除DNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。PCR反應(yīng)程序設(shè)定：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。ΔCT值為目的mRNA CT值與內(nèi)參mRNA CT值的差值，ΔΔCT為各實(shí)驗(yàn)組ΔCT與空白對照組ΔCT的差值，平均相對含量=2‐ΔΔCT。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

1.2.6 Western blot法檢測小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達(dá)稱取小鼠肝臟100 mg，加入已加入蛋白酶抑制劑的RIPA 1 ml，組織研磨，4℃12 500 r/min離心15 min，吸取上清于1.5 ml EP管中，BCA蛋白定量測定各組肝臟濃度，計(jì)算上樣量，加入2×上樣緩沖液，100℃變性5 min，每組按照60μg電泳，分離膠80 V 15 min，濃縮膠100 V 30 min，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100 V 80 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次15 min，二抗孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min，制備發(fā)光液，曝光，分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血脂水平與正常組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL‐C水平明顯升高（P＜0.01），HDL‐C明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖、辛伐他汀組TG、TC、LDL‐C水平明顯降低（P＜0.01），HDL‐C明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表1 Real time RT‐PCR的相關(guān)引物序列Tab.1 Related primer sequences of Real time RT‐PCR

2.2 各組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況HE染色：正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉中央可見呈發(fā)射狀排列的肝索和肝血竇。肝細(xì)胞圓形，胞質(zhì)均質(zhì)嗜酸性，細(xì)胞核較大、圓形；模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇受壓變窄。肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松，可見雙核肝細(xì)胞；茯苓多糖與辛伐他汀組肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)接近正常組。肝細(xì)胞呈條索狀排列，肝細(xì)胞索間可見肝血竇，肝細(xì)胞圓形，胞質(zhì)均質(zhì)嗜酸性，細(xì)胞核較大、圓形。見圖1A。

油紅O染色：正常組肝細(xì)胞內(nèi)未見細(xì)胞腫脹和脂肪變性；模型組肝細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂肪滴；茯苓多糖與辛伐他汀組肝組織中脂滴含量較模型組明顯減少，接近正常組。見圖1B。

2.3 各組小鼠血清SAA、S1P含量與正常組比較，模型組小鼠血清SAA含量明顯升高，S1P明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組SAA含量明顯降低，S1P含量明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

2.4 各 組 小 鼠 肝 臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達(dá)與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

表2 各組小鼠血清TG、TC、HDL‐C、LDL‐C水平（±s）Tab.2 Levels of TG，TC，HDL‐C and LDL‐C in serum of mice in each group（±s）

表2 各組小鼠血清TG、TC、HDL‐C、LDL‐C水平（±s）Tab.2 Levels of TG，TC，HDL‐C and LDL‐C in serum of mice in each group（±s）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.01；compared with the model group，2）P＜0.01.

圖1 各組小鼠肝臟HE、油紅O染色情況Fig.1 Staining of HE and Oil Red O in liver of mice in each group

圖2 各組小鼠血清SAA、S1P含量Fig.2 Contents of SAA and S1P in serum of mice in each group

圖3 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1mRNA表達(dá)情況Fig.3 Expression of PPARγ，LXRα，ABCA1，CYP7A1 and SR‐B1 mRNA in liver of mice in each group

圖4 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達(dá)情況Fig.4 Protein expression of PPARγ，LXRα，ABCA1，CYP7A1 and SR‐B1 in liver of mice in each group

2.5 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達(dá)與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

AS以動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積、細(xì)胞死亡和斑塊纖維化為特征，是冠心病、腦梗死、外周血管狹窄等多種缺血性心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，目前認(rèn)為是一種特殊形式的慢性炎癥，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，防治AS具有重要意義［7‐8］。中醫(yī)將其歸為“心悸”“胸痹”“中風(fēng)”“脈痹”“脫疽”的范疇，認(rèn)為多由本虛標(biāo)實(shí)所致。脾氣虛弱無力，水谷精微失于運(yùn)化，水濕內(nèi)生，聚而為痰，瘀阻脈絡(luò)，成痰瘀阻絡(luò)之勢，日久形成AS等心腦血管疾病。《諸病源候論·諸痰論》曰：“諸痰者，此由血脈壅塞，飲水積聚而不消散，故成痰也”，說明“血中之痰濁”是血脂異常、AS的致病因素［9］。茯苓多糖是茯苓的主要單體成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗遺傳損傷、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒、抗氧化、護(hù)肝催眠等藥理作用［10‐11］。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫，特別是巨噬細(xì)胞的吞噬活性，能通過活化肝臟細(xì)胞的AKT信號(hào)通路，抑制NF‐κB信號(hào)通路改善肝損傷［12］。臨床在心血管疾病治療上常采用桂枝與茯苓協(xié)同防治心血管疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道，二者協(xié)同具有抑制NF‐κB及MMP‐2的表達(dá)作用，從而重塑進(jìn)程動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型心臟微小血管，顯著降低血清和腦組織中TNF‐α、ET‐1水平，提高缺血腦組織的供血速度，對缺血腦組織啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制［13］。茯苓多糖可通過抑制IL‐33/ST2信號(hào)通路的激活，減少肥大細(xì)胞活化，抑制炎癥因子的表達(dá)，降低結(jié)腸炎癥浸潤程度［14］。關(guān)于茯苓多糖對肝臟脂質(zhì)代謝方面的研究尚不多見［15‐16］。因此，針對脾虛痰濁內(nèi)生的中醫(yī)病機(jī)，課題組采用具有健脾化痰功效的茯苓的主要成分茯苓多糖作為藥物干預(yù)，探討其是否通過調(diào)節(jié)肝臟膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程進(jìn)而改善AS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，茯苓多糖能夠顯著降低血清TG、TC、LDL‐C水平，升高HDL‐C水平，肝臟組織結(jié)構(gòu)接近于正常，肝細(xì)胞呈條索狀排列，肝細(xì)胞索間可見肝血竇，脂肪空泡明顯減輕，表明茯苓多糖可在一定程度上改善血脂水平，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，進(jìn)而改善AS。

眾所周知，HDL‐C是AS的保護(hù)因素，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)單純增加HDL‐C的數(shù)量并不能有效降低AS的風(fēng)險(xiǎn)，人們逐漸意識(shí)到HDL不單純是量的改變，更應(yīng)該關(guān)注質(zhì)的變化［17］。國際上，將正常的HDL稱為功能性HDL，其具有抗氧化、抗炎、抗血栓、促纖溶以及改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等生物學(xué)活性。在急性期、慢性炎癥及一些代謝性疾病中，HDL會(huì)發(fā)生一系列的病理性修飾，導(dǎo)致其組成成分以及功能基團(tuán)發(fā)生改變，將此類HDL稱為“失功能HDL”（dyHDL）［18］。S1P具有抗AS的作用，存在于HDL外層，是鞘磷脂代謝的中間產(chǎn)物之一，既可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使發(fā)揮作用，又可與HDL表面上的特定細(xì)胞受體（S1PR）結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［19‐21］。血漿中60%～80%的S1P通過ApoM與HDL結(jié)合，參與調(diào)節(jié)HDL的抗氧化、抗炎等效應(yīng)［22］。臨床研究證明HDL‐S1P含量與冠心病程度呈負(fù)相關(guān)，我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，冠心病PCI術(shù)后HDL‐S1P含量高的患者，再狹窄率顯著降低［23］。SAA是一種急性相反應(yīng)蛋白，與脂蛋白相聯(lián)系，在炎癥發(fā)生時(shí)，SAA的表達(dá)會(huì)升高1 000倍，取 代HDL的 主 要 載 脂 蛋 白ApoAI［24］。SAA會(huì)牢牢吸住位于動(dòng)脈壁上的HDL，抑制HDL與周圍細(xì)胞膽固醇結(jié)合，抑制LCAT活性，從而降低了ApoAI介導(dǎo)的RCT，且加速血液循環(huán)中HDL的清除。有研究表示HDL組分SAA/ApoAI比值具有評(píng)估dyHDL含量的價(jià)值［25］。因此，通過檢測血清S1P、SAA含量可側(cè)面反映dyHDL含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠血清S1P明顯降低，SAA明顯升高，說明ApoE‐/‐小鼠HDL功能明顯降低。與模型組比較，茯苓多糖及辛伐他汀組小鼠血清S1P明顯升高，SAA明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明茯苓多糖能夠糾正HDL失功能狀態(tài)改善AS。

PPARγ為過氧化物酶體增殖物激活受體家族一員，主要分布于肝臟和脂肪組織中，在調(diào)控糖脂代謝、抗炎、抗AS的發(fā)展中具有重要作用。PPARγ通過激活下游效應(yīng)分子上調(diào)ABCA1和SR‐B1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的流出，抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，抑制AS的形成［26‐27］。LXRα是核受體超家族成員，在肝臟、腎臟、巨噬細(xì)胞中大量分布，具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用，通過調(diào)控下游基因AB-CA1，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)［28‐29］。機(jī)體內(nèi)膽固醇清除的經(jīng)典有效途徑是在膽固醇7α‐羥化酶（CYP7A1）的作用下生成膽汁酸，而CYP7A1基因是LXRα的下游基因，故LXR‐α也有調(diào)控膽汁酸的作用［30］。SR‐B1能夠介導(dǎo)肝臟攝取膽固醇并促進(jìn)膽汁分泌，從而促進(jìn)RCT，抑制AS的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)dyHDL可阻礙RCT過程，存在于HDL外膜的SAA、S1P等因子導(dǎo)致HDL失功能，抗氧化、抗炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等功能失調(diào)，阻礙RCT的發(fā)生，肝臟脂質(zhì)代謝失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致AS的發(fā)生［31］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、SR‐B1、CYP7A1 mRNA、蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，茯苓多糖與辛伐他汀組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、SR‐B1、CYP7A1 mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高，綜合ELISA結(jié)果中茯苓多糖組SAA表達(dá)下調(diào)、S1P表達(dá)上調(diào)，說明茯苓多糖能夠通過恢復(fù)HDL功能并促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)通路PPARγ‐LXRα‐AB-CA1改善ApoE‐/‐小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，防治AS。

基于以上研究，本課題組認(rèn)為茯苓多糖可能通過抑制dyHDL，即恢復(fù)HDL功能并通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)通路PPARγ‐LXRα‐ABCA1改善ApoE‐/‐小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況，有望為茯苓多糖防治心腦血管疾病提供新的思路和方法。有關(guān)茯苓多糖的含量，給藥時(shí) 間 與改善HDL功能并通過PPARγ/LXRα/AB-CA1抗AS有否依賴關(guān)系，本課題組還會(huì)進(jìn)一步研究，并在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。