郭黎彥 馬 南 何志義（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種高發(fā)病率的慢性疾病，其主要特征是慢性氣道炎癥、黏液高分泌和氣道高反應(yīng)性，同時(shí)具有異質(zhì)性，危險(xiǎn)因素、嚴(yán)重程度、治療效果、遺傳學(xué)和自然史各不相同［1-2］。哮喘病因復(fù)雜，誘發(fā)及參與哮喘發(fā)病的因素很多，其發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，可能與遺傳、免疫、環(huán)境等有關(guān)［2-4］。單個(gè)核細(xì)胞與體內(nèi)免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并在哮喘激素抵抗中發(fā)揮重要作用［5-6］，因此對(duì)單個(gè)核細(xì)胞基因?qū)用鎸?duì)哮喘的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探索，可以為臨床診斷、治療和預(yù)防提供新的方向。

疾病的發(fā)生發(fā)展往往涉及多個(gè)基因之間相互作用，隨著基因組學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，篩選與臨床癥狀關(guān)系密切基因的技術(shù)愈加成熟，利用生物信息學(xué)技術(shù)可以在整個(gè)基因組層面對(duì)疾病的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是一種識(shí)別與表型性狀相關(guān)的基因模塊和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的方法，其完全基于一個(gè)無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)來確定基因之間的關(guān)系，從而識(shí)別高度相關(guān)的基因模塊（簇）［7-8］。本研究采用WGCNA算法分析從GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數(shù)據(jù)庫下載哮喘相關(guān)外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，研究與哮喘臨床癥狀相關(guān)的基因模塊以及模塊中的關(guān)鍵基因，整合分析這些基因的表達(dá)也許能為哮喘發(fā)病機(jī)制研究提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)集GSE19301，該數(shù)據(jù)集收集了哮喘穩(wěn)定期、加重期和加重期后兩周哮喘患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞?；蛐酒奶结樧⑨屝畔⒊鲎訟ffymetrix公司。

1.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理 通過R語言（3.5.1版）的Affy包可以將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾、標(biāo)準(zhǔn)化及對(duì)數(shù)化，盡可能減少誤差；導(dǎo)出數(shù)據(jù)后，將臨床信息缺失的數(shù)據(jù)篩除，最終留取674例患者數(shù)據(jù)用于分析。

1.3 WGCNA模塊構(gòu)建及可視化 利用R語言（3.5.1版）中的WGCNA包構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和基因模塊，同時(shí)找到與支氣管哮喘臨床癥狀關(guān)系密切的基因模塊，使用Cytoscape中Cytohubba插件從這些基因模塊中提取Hub基因，對(duì)提取出的Hub基因在京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）中進(jìn)行通路富集分析，并在基因本體聯(lián)合會(huì)（Gene Onotology Consortium）創(chuàng)建的GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因富集分析。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢測 通過RMA（robust muti-arrayaverage）一體化算法可對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、對(duì)數(shù)化處理，用于減少系統(tǒng)誤差，增加數(shù)據(jù)的可信度。未見明顯的離群值，表明該數(shù)據(jù)集可進(jìn)一步分析（圖1）。

2.2 層次聚類分析 對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類分析，比較基因聚類模塊與外周血單個(gè)核細(xì)胞比例、哮喘嚴(yán)重程度和藥物使用情況，判斷聚類結(jié)果的合理性，分析結(jié)果見圖2?？梢钥闯龌蚰K與外周血單個(gè)核細(xì)胞比例、哮喘嚴(yán)重程度、白三烯受體拮抗劑使用情況、糖皮質(zhì)激素使用匹配良好。

2.3 軟閾值確定 WGCNA算法需要選擇恰當(dāng)?shù)能涢撝凳沟没蚝突蛑g滿足無尺度網(wǎng)絡(luò)分布。選擇的軟閾值β值滿足lognd=kα-logk，同時(shí)相關(guān)系數(shù)R2大于0.8時(shí)，則符合無尺度網(wǎng)絡(luò)定義［9］。如圖3所示，當(dāng)軟閾值取8時(shí)可使R2＞0.8并且逐漸穩(wěn)定，此時(shí)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)符合無尺度網(wǎng)絡(luò)分布。

2.4 動(dòng)態(tài)剪枝法構(gòu)建基因共表達(dá)模塊 用動(dòng)態(tài)剪枝法計(jì)算特征基因（module eigengenes，ME），把相似度接近的模塊整合起來，共獲得15個(gè)基因模塊。每種模塊有其所對(duì)應(yīng)的顏色，需要說明的是grey模塊中的基因未被納入任何基因模塊。結(jié)果如圖4。

2.5 模塊與臨床信息的相關(guān)性分析 對(duì)15個(gè)模塊基因與臨床信息之間的相關(guān)性逐一進(jìn)行分析。圖5中salmon、green、magenta模塊與哮喘的臨床表型有較高的相關(guān)性，提示在哮喘發(fā)病機(jī)制中這3個(gè)模塊中的基因可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖1 離群值檢測和篩查Fig.1 Outliers detection and screening

圖2 哮喘樣本層次聚類分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of asthma samples

2.6 熱圖（TOM plot）分析 層級(jí)聚類后，隨機(jī)抽取400個(gè)基因，進(jìn)行各模塊基因相關(guān)性分析。層次聚類樹的分支對(duì)應(yīng)著不同模塊，逐漸飽和的黃色和紅色表明模塊中的基因相關(guān)性逐漸增高。圖6為各模塊基因相關(guān)性分析結(jié)果。

2.7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interactionnetwork，PPInetwork）構(gòu)建 使用String網(wǎng)站分析salmon、green、magenta模塊中基因的相互作用，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)越趨向黃色則在互作網(wǎng)絡(luò)中聚類等級(jí)越高，節(jié)點(diǎn)越大則在網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性越大?；プ鬟B線（Edge）顏色趨向黃色則表示二者相關(guān)系數(shù)越高，線條越粗則表示二者共表達(dá)可能性越大。見圖7。

2.8 Hub基因提取 Hub基因即互作網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因，是指在特定群體中具有高網(wǎng)絡(luò)連接度的基因，與模塊的臨床特征密切相關(guān)，在信號(hào)通路中發(fā)揮著對(duì)其他基因的調(diào)控作用，同時(shí)在生物學(xué)過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［7］。使用Cytoscape軟件提取出PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性最高的15個(gè)Hub基因（TCN1、ARG1、ELANE、CXCL1、PGLYRP1、CAMP、LTF、ORM1、SLPI、MMP-8、RETN、OLFM4、LCN2、CRISP3、HP），并進(jìn)行可視化分析。各基因在共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵性與顏色深淺有關(guān)，顏色深提示基因關(guān)鍵，該網(wǎng)絡(luò)中前6個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因分別是：CAMP、HP、MMP-8、CXCL1、ELANE、ARG1，結(jié)果見圖8。

圖3 樣本軟閾值確定Fig.3 Determination of soft threshold for samples

圖4 動(dòng)態(tài)剪枝法構(gòu)建聚類樹狀圖以及基因共表達(dá)模塊Fig.4 Construction of clustering dendrogram and gene co-expression modules by dynamic pruning method

2.9 KEGG信號(hào)通路富集分析 KEGG富集分析上述提取出的Hub基因，如圖9。分析結(jié)果顯示Hub基因的功能富集主要集中在癌癥的轉(zhuǎn)錄、代謝、金黃色葡萄球菌感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。

2.10 GO富集分析 GO富集分析上述提取出的Hub基因，如圖10。GO富集分析顯示Hub基因主要與中性粒細(xì)胞活化、脫顆粒、參與及介導(dǎo)免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān)。

圖5 模塊基因與臨床信息相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of correlation between module genes and clinical information

圖6 熱圖（TOM plot）分析模塊基因間的相關(guān)性Fig.6 Intergenic correlation of modules by TOM plot

圖7 模塊中基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 PPI network of genes in modules

圖8 Hub基因及其相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化Fig.8 Visualization of Hub gene′interaction network

圖9 KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果Fig.9 Functional enrichment analysesfor KEGGcategory

圖10 GO生物學(xué)過程富集分析結(jié)果Fig.10 Functional enrichment analyses for GO category

3 討論

本研究納入的GSE19301數(shù)據(jù)集是哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，用WGCNA算法分析該數(shù)據(jù)集，確定salmon、green、magenta模塊與哮喘臨床表型有較高相關(guān)性，用String網(wǎng)站分析salmon、green、magenta模塊中蛋白互作關(guān)系，使用Cytoscape提取出15個(gè)可能對(duì)哮喘起關(guān)鍵作用的Hub基 因：CAMP、HP、MMP-8、CXCL1、ELANE、ARG1、TCN1、PGLYRP1、LTF、ORM1、SLPI、RETN、OLFM4、LCN2、CRISP3。之前的研究顯示：CAMP及其活性產(chǎn)物L(fēng)L-37（CAMP/LL-37）不僅具有廣譜的抗菌活性，而且可以調(diào)控免疫細(xì)胞趨化及分化、炎性反應(yīng)的發(fā)生、炎性細(xì)胞損傷修復(fù)、腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡等，促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展［10-11］。同時(shí)LL-37是一種嗜酸性粒細(xì)胞激活肽，有利于嗜酸性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)并加重哮喘［12-13］。血清觸珠蛋白（haptoglobin，Hp）是急性期反應(yīng)物蛋白之一，已被報(bào)道與支氣管高反應(yīng)性有關(guān)［14］。在既往研究中，基質(zhì)金屬蛋白酶-8（matrix metalloproteinase 8，MMP-8）在哮喘患者黏膜下炎癥細(xì)胞、腺體和脫落區(qū)支氣管上皮細(xì)胞中具有顯著的免疫反應(yīng)性，而在完整的支氣管上皮細(xì)胞中則不存在。在嚴(yán)重哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中，MMP-8轉(zhuǎn)換為活性形式，而在哮喘穩(wěn)定期患者或健康對(duì)照者的BALF中則沒有。表明MMP-8及其激活在哮喘的氣道破壞、愈合、重塑和治療反應(yīng)中起重要作用［15-16］。吸入糖皮質(zhì)激素可對(duì)MMP-8的產(chǎn)生進(jìn)行下調(diào)，緩解哮喘癥狀［17］。氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）遷移是哮喘氣道重塑的重要機(jī)制。CXCL1是肥大細(xì)胞體外趨化氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)物的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)ASMC遷移具有抑制作用，可使哮喘緩解［18-19］。ARG1是一種新的兒童和成人哮喘支氣管擴(kuò)張劑反應(yīng)基因，可反映患者對(duì)短效支氣管擴(kuò)張劑的敏感性［20-21］。在以中性粒細(xì)胞表型為主的嚴(yán)重哮喘中，中性粒細(xì)胞內(nèi)TCN1上調(diào)［22］。PGLYRP1主要通過對(duì)宿主腸道微生物群的影響來增強(qiáng)過敏性哮喘反應(yīng)，并且和RETN一樣，與哮喘控制不良有關(guān)［23-24］。研究顯示，SLPI表達(dá)可降低氣道高反應(yīng)性，其產(chǎn)物與吸入型糖皮質(zhì)激素結(jié)合可使氣道高反應(yīng)性進(jìn)一步降低［25］。LTF可以通過減少血清中的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6，并抑制Treg從而參與非特異性免疫［26］。LTF通過與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞上的特異性受體相互作用，抑制NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)組織修復(fù)，減輕外界刺激引起的炎癥反應(yīng)［27］。ORM1被認(rèn)為具有抗炎作用，因?yàn)樗軌蛞种浦行粤＜?xì)胞的活化和補(bǔ)體活性，促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1RA，并調(diào)節(jié)人類單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子［28］。LCN2是一種與吸煙相關(guān)的氣道炎癥和肺實(shí)質(zhì)損傷相關(guān)的中性粒細(xì)胞源性炎癥分子，作為廣泛接受的中性粒細(xì)胞炎癥標(biāo)志物，哮喘-COPD重疊（asthma COPDoverlap，ACO）患者血漿LCN2水平明顯高于哮喘患者，ROC曲線分析證實(shí)LCN2有鑒別ACO患者與哮喘患者的作用［29］。此外，ELANE、OLFM4、CRISP3在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用尚無相關(guān)研究，可對(duì)其進(jìn)一步探查。為了解這些Hub基因參與的信號(hào)通路及生物學(xué)過程，對(duì)其進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路和GO富集分析。KEGG結(jié)果顯示，Hub基因主要參與癌癥的轉(zhuǎn)錄、代謝、金黃色葡萄球菌感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。GO富集分析顯示Hub基因主要與中性粒細(xì)胞活化、脫顆粒、參與及介導(dǎo)免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān)，這些生物學(xué)過程多與哮喘發(fā)生發(fā)展相聯(lián)系。

哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到多種基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子。但現(xiàn)有的多數(shù)研究基于單個(gè)基因、蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子，或單個(gè)通路，缺乏對(duì)整個(gè)基因組的研究和探索。目前高通量生物技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)，允許在特定樣本中同時(shí)監(jiān)測數(shù)千個(gè)參數(shù)。WGCNA作為數(shù)據(jù)探索工具或基因篩選方法，專注于基因集而不是單個(gè)基因。它不是將數(shù)千個(gè)基因與臨床結(jié)果聯(lián)系起來，而是側(cè)重于幾個(gè)模塊與臨床特征之間的關(guān)系［30］。在數(shù)千個(gè)基因中識(shí)別出與臨床表型最相關(guān)的基因模塊，并從中提取Hub基因。

本文所有研究均以現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，我們下一步的工作重點(diǎn)是應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法探究Hub基因?qū)ο恼{(diào)控作用以及這些基因產(chǎn)物在哮喘機(jī)制中所發(fā)揮的作用。因?yàn)橄嗤蛟诓煌M織和細(xì)胞中表達(dá)存在差異，而GSE19301數(shù)據(jù)集的組織細(xì)胞來源為外周血單個(gè)核細(xì)胞，Hub基因在其他不同細(xì)胞中是否也能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，也需要生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。此外，研究關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的作用也是我們今后工作的重要內(nèi)容。同時(shí)，本研究的不足之處在于僅僅基于單個(gè)基因集，未能對(duì)哮喘穩(wěn)定期及急性加重期患者的差異基因進(jìn)行分析。

綜上所述，本研究使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建出與哮喘臨床癥狀相關(guān)的基因模塊并提取出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，研究結(jié)果為探究哮喘的發(fā)病機(jī)制提供了指導(dǎo)，并為哮喘的預(yù)防和治療提供了方向，在哮喘機(jī)制研究中首次嘗試使用WGCNA分析，為發(fā)現(xiàn)更多的潛在靶點(diǎn)提供新思路。