戴 睿 林 萍 宋精玲 周 瑩 楊 耘 唐 瑩

（昆明醫(yī)科大學科技成果孵化中心電子顯微鏡室，昆明650500）

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，早期以手術切除以及放化療等傳統(tǒng)方法為主，但易轉移、易復發(fā)、易產(chǎn)生抗性和毒副作用大。新出現(xiàn)的靶向治療特異性強，毒副作用小，成為乳腺癌新的治療方法［1-2］。miRNA是一類內源性非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)其參與乳腺癌的生長和轉移，也參與細胞耐藥和抵抗等，可作為臨床診斷、預后標志及有效的治療靶點［3-5］。有研究報道m(xù)iR-541-3p在非小細胞肺癌組織和血漿中下調表達，與TNM分期和術后生存期相關，過表達miR-541-3p通過靶向轉化生長影響因子2（transform growth interacting factor 2，TGIF2）抑制非小細胞肺癌細胞的生長和轉移［6］。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-541-3p在神經(jīng)病理性疼痛大鼠海馬中下調表達［7］。包含1個基因的SPOC結構域（SPOC domain containing 1 gene，SPOCD1）是屬于S-Ⅱ（TFⅡS）家族的轉錄因子，有研究報道SPOCD1在胃腫瘤中過表達，敲除SPOCD1減少了胃癌細胞增殖，遷移和侵襲，以及裸鼠中異種移植腫瘤的生長［8］。SPOCD1在人咀嚼黏膜傷口愈合期間顯著上調表達［9］。然而miR-541-3p和SPOCD1在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響尚未闡明。本實驗旨在研究miR-541-3p和SPOCD1對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及miR-541-3p是否通過調控SPOCD1影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料 正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37購自美國菌種保藏中心（ATCC）；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；抗體購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購自北京明陽科華生物科技有限公司；miRcon、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、sicon、si-SPOCD1、pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1載體質粒購自上海斯信生物科技有限公司。Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞融和至80%～90%時消化傳代。

1.2.2 細胞處理與分組 取對數(shù)生長期細胞MCF-7無血清培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，將miR-con、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、si-con、si-SPOCD1分別轉染至MCF-7細胞中，分別記為miRcon組、miR-541-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-541-3p組、si-con組、si-SPOCD1組；將miR-541-3p質粒分別與pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1共轉染至MCF-7細胞中，分別記為miR-541-3p+pcDNA-con組、miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-541-3p和SPOCD1 mRNA表達水平 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA后進行PCR，每個樣品設3個復孔，反應條件為95℃3 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；相對表達量用2-ΔΔCt計算。miR-541-3p和SPOCD1分別以U6和β-actin為內參，miR-541-3p上游引物序列：5'-GCGGATCCAGTTTCCAGAACACCCAGAT-3'，下游引物序列：5'-GCAAGCTTAAAAAACGACAAGCACGTCATAGA-3'；U6上游引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3'，下游引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。SPOCD1上游引物序列：5'-CTCCCCAAGTTGCTGACCTG-3'，下游引物序列：5'-CCCCTGTAGCGGGCAAATATC-3'；βactin上游引物序列：5'-TTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物序列：5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3'。

1.2.4 Western blot檢測SPOCD1、CyclinD1、MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表達水平 培養(yǎng)48 h后的各組細胞提取總蛋白，BCA試劑盒對蛋白進行定量。通過SDS-PAGE電泳將蛋白轉至PVDF膜，封閉液封閉1 h后加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，Tris鹽吐溫緩沖液（Tris buffer solution tween，TBST）洗膜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液顯影，ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平即為目的條帶和β-actin條帶比值。

1.2.5 MTT檢測細胞存活率 取培養(yǎng)48 h的細胞加入MTT溶液，37℃孵育4 h，加入150μl DMSO，490 nm處用酶標儀檢測各孔吸光度（OD）值。細胞存活率（%）即為實驗組OD值和空白對照組OD值比值。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗：Transwell小室上室和下室中分別加入200μl細胞懸液和500μl RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后先用4%多聚甲醛固定再用0.1%結晶紫染色，最后在顯微鏡觀察并拍照，結晶紫染色細胞數(shù)即為遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：先用Matrigel包被Transwell小室的上室，然后按照細胞遷移實驗進行。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-541-3p對SPOCD1的靶向調控 構建含有miR-541-3p結合位點的SPOCD1-3′UTR野生型及突變型報告基因載體，在MCF-7細胞中轉染miR-541-3p mimics、野生型及突變型報告基因載體。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

圖1 Western blot檢測SPOCD1蛋白表達Fig.1 Western blot detection of SPOCD1 protein expression

2.1 在乳腺癌細胞系中miR-541-3p和SPOCD1的表達 與正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37中miR-541-3p表達水平降低，SPOCD1 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）（圖1、表1）。

2.2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中miR-541-3p表達水平顯著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低，細胞存活率顯著降低，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05，圖2、表2）。過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲。

2.3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比，si-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低，細胞存活率顯著降低，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05，表3、圖3）?？梢娗脺pSPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲。

表1 乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表達量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-541-3p，SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

表1 乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表達量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-541-3p，SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

Note：Compared with MCF-10A，1）P＜0.05.

SPOCD1 protein 0.20±0.03 1.12±0.121）0.95±0.101）0.88±0.091）Groups miR-541-3p MCF-10A MCF-7 T47D Bcap-37 1.00±0.12 0.35±0.031）0.40±0.041）0.45±0.051）SPOCD1 mRNA 1.00±0.15 2.01±0.201）1.86±0.191）1.75±0.181）

圖2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲Fig.2 Overexpression of miR-541-3p inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7

表2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7（±s，n=9）

表2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05.

Number of invasivecells 157.68±15.76 159.63±16.05 92.38±9.251）Groups miR-541-3p CyclinD1 MMP2 MMP9 NC miR-con miR-541-3p 1.00±0.13 1.10±0.12 1.88±0.191）1.20±0.15 1.15±0.12 0.35±0.041）0.98±0.10 0.99±0.11 0.22±0.031）0.88±0.08 0.85±0.08 0.26±0.031）Cell survival rate（%）100.08±10.10 100.35±10.25 54.69±5.451）Number of migratory cells 386.96±38.70 388.53±38.86 183.05±18.321）

2.4 miR-541-3p靶向SPOCD1 Starbase預測SPOCD1與miR-541-3p存在結合位點（圖4A）。熒光素酶報告實驗結果（表4）顯示，與miR-con組相比，miR-541-3p組轉染野生型SPOCD1表達載體的細胞MCF-7的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉染突變型SPOCD1表達載體的細胞MCF-7的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義。與miR-con組相比，miR-541-3p組SPOCD1表達水平顯著降低；與antimiR-con組，相比anti-miR-541-3p組SPOCD1表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖4，表5）。可見，miR-541-3p可靶向調控SPOCD1的表達。

2.5 高表達SPOCD1可以部分逆轉miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲的影響 與miRcon組相比，miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低，細胞存活率顯著降低，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與miR-541-3p+pcDNA-con組相比，miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著升高，細胞存活率顯著升高，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高（P＜0.05，圖5、表6）。高表達SPOCD1可以部分逆轉miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

表3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF-7（±s，n=9）

表3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with si-con，1）P＜0.05.

Number of invasivecells 158.96±15.86 155.76±15.89 80.46±8.051）Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 NC si-con si-SPOCD1 1.15±0.12 1.20±0.15 0.38±0.041）1.25±0.13 1.23±0.12 0.36±0.051）1.00±0.10 0.95±0.09 0.33±0.041）0.86±0.08 0.85±0.08 0.20±0.031）Cell survival rate（%）100.35±10.08 100.46±10.28 59.63±6.051）Number of migratory cells 388.32±38.86 384.38±38.45 176.35±17.651）

圖3 Western blot檢 測SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表達Fig.3 Western blot detection of protein expressions of SPOCD1，CyclinD1，MMP2 and MMP9

表4 miR-con或miR-541-3p與報告質粒共轉染MCF-7細胞后雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells（±s，n=9）

表4 miR-con或miR-541-3p與報告質粒共轉染MCF-7細胞后雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）＜0.05.

Groups MUT 1.01±0.12 1.03±0.14 miR-con miR-541-3p luciferaseactivity WT 1.00±0.10 0.36±0.041）

圖4 miR-541-3p靶向調控SPOCD1表達Fig.4 miR-541-3p targeted regulation of SPOCD1 expression

表5 Western blot檢測SPOCD1的表達（±s，n=9）Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression（±s，n=9）

表5 Western blot檢測SPOCD1的表達（±s，n=9）Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with anti-miRcon，2）P＜0.05.

SPOCD1 1.21±0.13 0.36±0.041）1.18±0.12 1.56±0.162）Groups miR-con miR-541-3p anti-miR-con anti-miR-541-3p

圖5 Western blot檢 測SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達Fig.5 Western blot detection of SPOCD1，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expression

圖6 Western blot檢測β-catenin蛋白表達Fig.6 Western blot detection ofβ-catenin protein expression

表6 高表達SPOCD1可部分逆轉miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation，migration and invasion of MCF-7（±s，n=9）

表6 高表達SPOCD1可部分逆轉miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation，migration and invasion of MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with miR-541-3p+pcDNA-con，2）P＜0.05.

Number of invasive cells 160.38±16.05 90.38±9.081）91.35±9.15 121.37±12.152）Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1 1.20±0.12 0.32±0.041）0.35±0.05 1.05±0.112）1.18±0.14 0.33±0.041）0.34±0.07 0.96±0.102）1.01±0.10 0.30±0.051）0.32±0.04 0.88±0.092）0.86±0.09 0.22±0.041）0.24±0.05 0.70±0.082）Cell survival rate（%）100.22±10.20 53.75±5.381）52.68±5.27 86.34±9.002）Number of migratory cells 387.25±38.73 184.28±18.431）182.38±18.25 328.69±32.882）

表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=9）

表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with miR-541-3p+pcDNA-con，2）P＜0.05.

β-catenin 1.10±0.11 0.40±0.041）0.45±0.05 0.92±0.092）Groups miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1

2.6 Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達 與miRcon組相比，miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中βcatenin表達水平顯著降低（P＜0.05）；與miR-541-3p+pcDNA-con組相比，miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中β-catenin表達水平顯著升高（P＜0.05，圖6、表7）?？梢姡琺iR-541-3p過表達抑制Wnt/β-catenin通路的激活，而高表達SPOCD1可以部分逆轉miR-541-3p高表達對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。

3 討論

分子靶向治療已在乳腺癌中取得一定進展，并已成為乳腺癌的有效治療手段之一［10］。miRNA是一種參與細胞各種生理過程的小RNA分子，也參與腫瘤的發(fā)展，并可作為腫瘤治療的特異性靶點［11］。有研究報道m(xù)iR-541在肝癌中低表達，過表達miR-541抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加肝癌細胞株對索拉菲尼、阿霉素的敏感性［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LOXL1-AS1通過調控miR-541-3p和CCND1影響前列腺癌細胞增殖和細胞周期進程［13］。本實驗結果顯示，在乳腺癌細胞中miR-541-3p表達水平顯著降低，miR-541-3p過表達降低了細胞存活率和細胞遷移、侵襲數(shù)量，降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平。說明miR-541-3p過表達抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

SPOCD1與腫瘤相關，有研究發(fā)現(xiàn)SPOCD1在膠質瘤中高表達，與晚期腫瘤分級和預后不良有關，敲減SPOCD1可抑制膠質瘤U373和U87細胞的增殖、遷移和侵襲［14］。SPOCD1在骨肉瘤細胞系中上調表達，下調SPOCD1抑制了MG63和SAOS2骨肉瘤細胞集落的形成和增殖能力，且敲減SPOCD1促進細胞凋亡［15］。本實驗結果顯示，在乳腺癌細胞中SPOCD1表達水平顯著升高，說明SPOCD1在乳腺癌中也高表達。且敲減SPOCD1降低了細胞存活率和細胞遷移、侵襲數(shù)量，降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平。說明敲減SPOCD1可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。SPOCD1在乳腺癌中的作用與在膠質瘤和骨肉瘤中的作用相似，說明SPOCD1確實參與腫瘤的進展。且本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-541-3p靶向調控SPOCD1，SPOCD1高表達能部分逆轉miR-541-3p高表達對細胞MCF-7增殖、遷移、侵襲的抑制作用。提示，miR-541-3p可能通過調控SPOCD1影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

研究發(fā)現(xiàn)異常活化的Wnt/β-catenin信號通路參與乳腺癌發(fā)生，其成員分子可作為miRNA的靶基因而受到調控，影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展［16］。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調控因子，βcatenin異常表達活化Wnt/β-catenin信號通路可促進乳腺癌淋巴細胞向腫瘤間質浸潤［17］。抑制Wnt/β-catenin信號通路激活可抑制乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲［18］。還有研究報道m(xù)iR-541-3p可能參與介導Wnt信號傳導途徑［19］。本實驗結果顯示，miR-541-3p過表達時β-catenin表達水平顯著降低，說明miR-541-3p過表達抑制Wnt/β-catenin信號通路。SPOCD1高表達能部分逆轉miR-541-3p高表達對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。提示miR-541-3p可能通過調控SPOCD1影響Wnt/β-catenin信號通路進而影響乳腺癌細胞的進展。

綜上所述，miR-541-3p過表達可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與SPOCD1和Wnt/β-catenin信號通路相關，也將為乳腺癌的治療提供新思路和新靶點。