方曉玲 宋和鑒 任 斐 李 艷 丁 婕 顧 艷

（連云港市第一人民醫(yī)院心功能室，連云港222000）

膿毒癥是一種因感染誘發(fā)宿主應(yīng)答失調(diào)而引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），具有發(fā)展快、死亡率高等特點(diǎn)，是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房患者多器官衰竭和死亡的主要原因。有研究顯示，血管通透性增高是影響膿毒癥患者預(yù)后與轉(zhuǎn)歸的重要因素［1］。正常的血管通透性是維持組織液生成和回流平衡的關(guān)鍵因素，而血管通透性增高可導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏，引起繼發(fā)性組織水腫、血容量不足、微循環(huán)障礙以及遠(yuǎn)端臟器損傷［2］。因而以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，維持正常內(nèi)皮屏障為目標(biāo)的干預(yù)方式或許是一種改善膿毒癥的有效方法。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種還原型谷胱甘肽前體，不僅具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，還具有舒張血管、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，臨床上廣泛用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面疾病的治療［3-4］。有研究表明，NAC主要從抗炎、抗氧化以及改善微循環(huán)等方面發(fā)揮改善膿毒癥的作用，但NAC對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響尚不清楚［5］。本研究擬采用膿毒癥患者血清干預(yù)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926為對(duì)象，探討NAC對(duì)膿毒癥血清誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞高通透性的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、藥物與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；ADAM10抑制劑GI254023X購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；NAC購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：A7250）；胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購(gòu)自上海碧云天公司；iScript cDNA合成試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；兔抗ADAM10、ZO-1、Occludin、VE-cadherin、β-actin及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.2 儀器 MK3型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自芬蘭雷勃公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX96購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；F-380型熒光分光光度計(jì)購(gòu)自天津港東科技股份有限公司；Millicell ERS-2型電阻儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集 選擇本院收治的10例膿毒癥休克患者和10例健康成年志愿者，取患者及志愿者外周靜脈血各5 ml，室溫放置30 min，待其自然凝固后4 000 r/min離心10 min，分離血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 將EA.hy926細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的恒溫孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行以下分組處理：空白對(duì)照組（Blank）：換用含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（CON）：換用含10%健康志愿者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；膿毒癥組（Sep）：換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；NAC低劑量組（NAC-L）：采用1 mmol/L NAC預(yù)處理24 h后，再換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；NAC高劑量組（NAC-H）：采用5 mmol/L NAC預(yù)處理24 h后，再換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；高劑量NAC聯(lián)合ADAM10抑制劑GI254023X組（NAC-H+GI254023X）：先采用20μmol/L GI2540 23X干預(yù)16 h，再添加5 mmol/L NAC處理24 h，最后換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)期EA.hy926細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后，以1×104個(gè)/ml濃度接種至96孔板中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育至約80%融合度時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先進(jìn)行NAC和GI254023X預(yù)處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0 h、3 h、6 h和12 h，設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，每孔加入10μl 5 mg/ml濃度的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μl二甲基亞砜，置于低速搖床上反應(yīng)10 min。最后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm處的吸光度。

1.2.4 qRT-PCR法檢測(cè)ADAM10 mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期EA.hy926細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先進(jìn)行NAC和GI254023X預(yù)處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞并采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA。使用cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板使用熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green Supermix）進(jìn)行定量檢測(cè)。引物序列：ADAM10 F：5′-ATGGGAGGTCAGTATGGGAATC-3′；R：5′-ACTGCTCTTTTGGCACGCT-3′；β-actin F：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；R：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，然后95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以β-actin為模內(nèi)部參考，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ADAM10 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell小室法測(cè)定單層細(xì)胞通透性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔濃度接種至Transwell上室中，培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先進(jìn)行NAC和GI254023X預(yù)處理，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓4 h，最后加入含有各血清的培養(yǎng)基，同時(shí)向上室培養(yǎng)基中加入100μl異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的葡聚糖（FD40），下室加入1 ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。采用熒光分光光度計(jì)分別檢測(cè)各組細(xì)胞Transwell下室培養(yǎng)液中FITC-FD40的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度比值代表單層細(xì)胞通透性。

1.2.6 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞的跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔濃度接種至Transwell上室中，培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先進(jìn)行NAC和GI254023X預(yù)處理，再分別將上室中培養(yǎng)基換成含有各血清的培養(yǎng)基，底層小室加入1 ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。將Millicell ERS電阻儀的兩片電極分別垂直置于Transwell上下室中，檢測(cè)各小室單層細(xì)胞電阻值。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞ADAM10蛋白、通透性相關(guān)蛋白Occludin、閉鎖小帶（ZO-1）、VE-cadherin表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期EA.hy926細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先進(jìn)行NAC和GI254023X預(yù)處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴裂解20 min后離心提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20μg蛋白沸水浴變性，采用SDS-PAGE技術(shù)分離目的蛋白，再用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加一抗兔抗ADAM10（1∶5 000）、Occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、VE-cadherin（1∶2 500）及β-actin（1∶5 000），于4℃孵育過(guò)夜。加入二抗室溫下孵育1 h，ECL顯影曝光后，用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果數(shù)據(jù)。結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用ANOVA方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t分析；兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC對(duì)膿毒癥血清刺激下EA.hy926細(xì)胞增殖活性的影響 如表1所示，0 h和3 h各組細(xì)胞OD值相互比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Blank組比較，6 h和12 h Sep組細(xì)胞OD值均顯著降低（P＜0.05），而CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sep組比較，6 h和12 h NAC-L組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而NAC-H組細(xì)胞OD值明顯增加（P＜0.05）；與NAC-H組比較，6 h和12 h NACH+GI254023X組細(xì)胞OD值又明顯增加（P＜0.05）。

2.2 NAC對(duì)膿毒癥血清刺激下EA.hy926細(xì)胞中ADAM10表達(dá)水平的影響 如圖1所示，與Blank組比較，Sep組細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），而CON組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而NAC-L組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NACH+GI254023X組細(xì)胞ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

2.3 NAC對(duì)膿毒癥血清誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞通透性及TEER值的影響 如圖2所示，與Blank組比較，Sep組EA.hy926細(xì)胞通透性明顯增加（P＜0.05），TEER值顯著降低（P＜0.05），而CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細(xì)胞通透性明顯降低（P＜0.05），TEER值顯著增加（P＜0.05），而NAC-L組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NAC-H+GI254023X組細(xì)胞通透性明顯降低（P＜0.05），TEER值顯著提高（P＜0.05）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)EA.hy926細(xì)胞OD值變化（±s）Tab.1 OD value change of EA.hy926 cells in each group for different times（±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)EA.hy926細(xì)胞OD值變化（±s）Tab.1 OD value change of EA.hy926 cells in each group for different times（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Blank；2）P＜0.05 vs Sep group；3）P＜0.05 vs NAC-H group.

12 h 0.612±0.093 0.606±0.089 0.392±0.0641）0.408±0.071 0.531±0.0862）0.577±0.0793）Groups Blank CON Sep NAC-L NAC-H NAC-H+GI254023X 0 h 0.364±0.068 0.371±0.072 0.368±0.059 0.370±0.070 0.371±0.052 0.376±0.061 3 h 0.379±0.061 0.380±0.055 0.371±0.063 0.370±0.056 0.373±0.038 0.376±0.051 6 h 0.442±0.037 0.441±0.050 0.383±0.0721）0.383±0.058 0.411±0.0432）0.438±0.0393）

圖1 各組EA.hy926細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.1 mRNA and protein expression of ADAM 10 in EA.hy926 cells of each group

圖2 各組EA.hy926細(xì)胞通透性和TEER值Fig.2 Cell permeability and TEER value of EA.hy926 cells in each group

2.4 NAC對(duì)膿毒癥血清刺激下EA.hy926細(xì)胞中VE-cadherin、ZO-1及Occludin蛋白表達(dá)量的影響如圖3所示，與Blank組比較，Sep組細(xì)胞中Occludin、ZO-1及VE-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細(xì)胞中Occludin、ZO-1及VEcadherin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），而NAC-L組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NAC-H+GI254023X組細(xì)胞中Occludin、ZO-1及VE-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。

圖3 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附蛋白VE-cadherin、ZO-1及Occludin表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of VE-cadherin，ZO-1，Occludin proteins in vascular endothelial cells of each group

3 討論

近年來(lái)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，NAC對(duì)膿毒癥所致的各器官功能損傷具有改善作用，而這些研究均基于NAC的抗炎抗氧化作用［6-7］。然而，臨床上運(yùn)用NAC治療膿毒癥的效果卻不盡人意，且爭(zhēng)議較大。研究顯示，靜脈注射N(xiāo)AC可降低膿毒癥患者體內(nèi)NF-κB活性，改善膿毒癥患者體內(nèi)氧化反應(yīng)［8］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，NAC干預(yù)治療并不能改善膿毒癥患者死亡率、細(xì)胞因子水平和機(jī)械通氣持續(xù)時(shí)間，甚至還可能加劇膿毒癥引起的心血管衰竭［9］。針對(duì)NAC對(duì)膿毒癥治療效果出現(xiàn)的歧義，其原因有可能與觀察樣本數(shù)量、給藥劑量、給藥途徑以及用藥時(shí)間長(zhǎng)短等因素有關(guān)，但不可否認(rèn)NAC對(duì)治療膿毒癥具有潛在價(jià)值，因而NAC在膿毒癥中更多的作用需要大量實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證和挖掘。

血管內(nèi)皮屏障是維持血管通透性的重要因素，然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞是膿毒癥誘導(dǎo)損傷的主要靶位。膿毒癥發(fā)生時(shí)，患者體內(nèi)相關(guān)炎癥因子以及毒素刺激全身血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，引起血管通透性增加，最終導(dǎo)致膿毒癥患者組織水腫以及各器官功能障礙［10］。臨床研究證實(shí)，膿毒癥患者通常會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性皮下水腫和體腔水腫，表明降低血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性可能成為改善膿毒癥的一種有效措施［11］。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，NAC可提高膿毒癥血清作用下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926的增殖活性。此外，由于本研究中NAC均為預(yù)處理，而膿毒癥血清作用0 h時(shí)各組細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著差異，這些結(jié)果表明NAC本身對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，與熊婷等［12］研究結(jié)果一致。隨后本研究利用Transwell細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NAC能夠降低膿毒癥血清誘導(dǎo)的EA.hy926高通透性。VE-cadherin是內(nèi)皮屏障緊密連接的主要跨膜黏附分子，膿毒癥相關(guān)促炎因子可通過(guò)降低環(huán)磷酸腺苷，損傷VE-cadherin介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞附著力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加［13］。而Occludin和ZO-1也是緊密連接蛋白，可維持細(xì)胞與細(xì)胞間的張力，是血管內(nèi)皮屏障形成的重要蛋白［2］。本研究結(jié)果顯示，NAC能夠上調(diào)膿毒癥血清作用下EA.hy926細(xì)胞Occludin、ZO-1及VE-cadherin等蛋白表達(dá)，說(shuō)明NAC通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而改善膿毒癥介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。

ADAM10是一種重要的α-分泌酶，能夠觸發(fā)連續(xù)的跨膜蛋白水解過(guò)程，可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞以及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子、黏附分子、受體和細(xì)胞因子的活性。有研究表明，ADAM10可特異性切割緊密連接蛋白VE-cadherin胞外結(jié)構(gòu)域，破壞細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加［14-15］。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥血清干預(yù)可促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)，表明膿毒癥介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加可能與ADAM10表達(dá)增加有關(guān)。然而，采用NAC干預(yù)可顯著降低膿毒癥血清誘導(dǎo)的ADAM10表達(dá)，提示NAC改善膿毒癥介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的機(jī)制可能與抑制ADAM10表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步采用ADAM10抑制劑GI254023X聯(lián)合NAC干預(yù)進(jìn)行證實(shí)，結(jié)果顯示GI254023X能顯著增強(qiáng)NAC對(duì)膿毒癥血清誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞高通透性的抑制作用，并顯著上調(diào)細(xì)胞緊密連接蛋白VE-cadherin、Occludin及ZO-1等蛋白表達(dá)水平，表明NAC可能通過(guò)抑制ADAM10表達(dá)進(jìn)而降低膿毒癥介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。

綜上所述，本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步闡明NAC可能通過(guò)抑制ADAM10表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞緊密連接蛋白VE-cadherin、Occludin及ZO-1的表達(dá)，維持細(xì)胞間的緊密連接，從而降低膿毒癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，初步為NAC治療膿毒癥微循環(huán)障礙提供理論依據(jù)，但本研究結(jié)論還有待動(dòng)物水平研究給予進(jìn)一步驗(yàn)證。