吳 晗，劉晨玢，毛胤祺，陳 煒，陳淑英

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)科，上海 200040

細胞因子是一種由淋巴細胞、單核細胞和成纖維細胞等產(chǎn)生的具有調(diào)控機體生長、細胞分化和相關(guān)免疫激活等作用的小分子蛋白質(zhì)，在感染、炎癥和癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，從而維持機體的穩(wěn)態(tài)[1]。目前，細胞因子常用的檢測方法主要包括細胞生物學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗和流式細胞術(shù)等[2]，其中流式細胞術(shù)能方便快捷地在單細胞濃度方面進行細胞因子等蛋白分子的檢測，具有準確、微量、高效的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于臨床及科研相關(guān)項目的檢測[3]，從而監(jiān)視體內(nèi)的炎癥和免疫狀態(tài)，為疾病篩查診斷、藥效評估及預(yù)后治療提供重要參考[4]。根據(jù)CNAS-CL02:2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則》的規(guī)定[5]，開展使用新項目前，實驗室必須對指標(biāo)的相關(guān)性能進行方法學(xué)驗證評估。本實驗室以血漿細胞因子作為檢測項目，通過測定這些細胞因子的精密度、準確度、線性范圍、最低檢測限、參考區(qū)間和抗干擾能力等，從而驗證實驗室使用的多重微球流式免疫熒光發(fā)光法在BD FACSCanto Ⅱ流式細胞分析儀上檢測8項細胞因子的性能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院健康體檢者及門急診住院患者的血漿標(biāo)本，應(yīng)確保標(biāo)本無溶血、脂血和血凝塊。

1.2儀器與試劑 BD FACSCanto Ⅱ流式細胞分析儀，青島瑞斯凱爾生物科技有限公司生產(chǎn)的8項細胞因子檢測試劑盒及其配套的具有溯源性的校準品，8項細胞因子檢測試劑盒[批號：191005，試劑成分：捕獲微球抗體、檢測抗體、鏈霉親和素(SA-PE)、實驗緩沖液、洗滌緩沖液(10×)]；校準品(批號：20190801)。

1.3方法

1.3.1檢測項目 本實驗室使用青島瑞斯凱爾生物科技有限公司生產(chǎn)的8項細胞因子檢測試劑盒，對體內(nèi)白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度和分布進行流式細胞術(shù)多參數(shù)檢測和分析。

1.3.2檢測原理 試劑盒基于免疫學(xué)分析方法，采用直接夾心法原理，與經(jīng)典的“三明治”免疫分析方法一致。以熒光發(fā)光微球作為免疫反應(yīng)的固相，利用免疫學(xué)分析方法與流式細胞分析儀分析相結(jié)合，用于測定人體血漿或血清中的細胞因子濃度。技術(shù)原理：熒光發(fā)光微球耦聯(lián)的細胞因子抗體與生物素標(biāo)記的細胞因子配對抗體和標(biāo)本或校準品中的細胞因子結(jié)合形成“三明治”復(fù)合物，再與加入的標(biāo)記有藻紅蛋白的SA-PE反應(yīng)。通過流式細胞分析儀進行熒光發(fā)光強度檢測，從而得到標(biāo)本中的細胞因子濃度。

1.3.3預(yù)處理 在進行性能驗證試驗前，必須對儀器進行相關(guān)校準和質(zhì)量控制檢測，確保儀器在控后方可開展性能檢測。

1.3.4檢測步驟 (1)將實驗用試劑恢復(fù)到室溫。(2)基質(zhì)準備：將5 mL實驗緩沖液加到凍干粉基質(zhì)中，靜置至少15 min，待凍干粉溶解，渦旋使其充分混勻。剩余的基質(zhì)分裝在EP管中，可儲存于-20 ℃1個月。(3)校準品制備：向校準品凍干粉中加入250 μL實驗緩沖液，使凍干粉完全充分溶解；室溫下靜置10 min，此溶液濃度為1 000.00 pg/mL，將其標(biāo)記為A7；準備6只空管，分別標(biāo)記為A6、A5、A4、A3、A2、A1；每只試管中加入75 μL實驗緩沖液，并進行倍比稀釋，即取25 μL A7溶液到A6中，充分混勻；同樣的方法，依次進行稀釋，分別得到A5、A4、A3、A2和A1校準品。A0中只加入實驗緩沖液。各校準品終濃度：A0為0.00 pg/mL，A1為2.44 pg/mL，A2為9.77 pg/mL，A3為39.06 pg/mL，A4為156.25 pg/mL，A5為625.00 pg/mL，A6為2 500.00 pg/mL，A7為10 000.00 pg/mL。(4)洗滌緩沖液配制：將穩(wěn)定到室溫，完全溶解的5 mL 10×洗滌緩沖液加到45 mL去離子水中。(5)標(biāo)本稀釋：血清或血漿標(biāo)本可根據(jù)實際情況使用實驗緩沖液進行適當(dāng)稀釋。(6)加樣：向校準品管中分別加入25 μL基質(zhì)和校準品，向標(biāo)本管中分別加入25 μL實驗緩沖液和稀釋的樣品。向所有管中加入25 μL捕獲微球抗體，震蕩混勻1 min，再加入25 μL檢測抗體，用錫箔紙包被管子，室溫(25±1)℃避光震蕩2 h。加入25 μL SA-PE，用錫箔紙包被管子，室溫(25±1)℃避光震蕩0.5 h，2 500 r/min離心5 min,去除上清液，加入200 μL 10×洗滌緩沖液，通過渦旋將微球重懸(30 s)，離心(1 600 r/min，5 min)去除上清液。根據(jù)流式細胞分析儀上樣需求，向每管中加入150～300 μL洗滌緩沖液，通過渦旋將微球重懸，上機檢測。

1.3.5精密度驗證試驗 采用兩種不同值的具有溯源性的校準品；參考WS/T492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》要求[6]，首先將校準品凍干粉按要求配置成溶液，注意校準品需現(xiàn)配現(xiàn)用，并按規(guī)定儲存。分別檢測線性范圍內(nèi)的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ和TNF-α精密度參考品各2份，濃度為2 500 pg/mL(P1)、625 pg/mL(P2)。對精密度校準品進行為期5 d的連續(xù)檢測，每天對同一濃度的精密度具有溯源性的校準品進行5次測定,每份標(biāo)本得到25組數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果，計算其變異系數(shù)(CV)值。判斷標(biāo)準：(1)精密度誤差范圍應(yīng)小于該項目在醫(yī)學(xué)上允許的最大誤差范圍，原則上應(yīng)小于廠家提供的范圍。如果無法滿足，則應(yīng)參照CLIA′88等其他資料提供的可接受范圍。如果上述情況均未滿足，則該項目的最大允許誤差應(yīng)由實驗室自建。(2)廠家提供的精密度范圍CV≤15%，分別計算本實驗室批內(nèi)和批間兩組數(shù)據(jù)的CV，若CV均≤15%，則表明廠家聲明的精密度通過驗證。(3)如果計算所得CV≥15%，考慮到人為實驗操作誤差，則每種濃度增加5次孵育實驗上機檢測，將所得數(shù)據(jù)與之前數(shù)據(jù)合并計算，剔除明顯人為誤差的數(shù)據(jù)，每組剔除數(shù)據(jù)必須≤2個，以增加結(jié)果的可靠程度，若CV均≤15%，則表明廠家聲明的精密度通過驗證。

1.3.6準確度驗證試驗 采用具有溯源性的校準品進行準確度驗證。分別檢測線性范圍濃度內(nèi)的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ和TNF-α準確度參考品各2份，濃度為2 500 pg/mL(P1)和625 pg/mL(P2)。對準確度校準品進行為期5 d的連續(xù)檢測，每天對同一濃度的準確度校準品進行3次測定，每份標(biāo)本得到15組數(shù)據(jù)，記錄數(shù)據(jù)并分析統(tǒng)計結(jié)果。判斷標(biāo)準：(1)準確度誤差范圍應(yīng)小于該項目醫(yī)學(xué)上允許的最大誤差范圍，原則上應(yīng)滿足廠家聲明的范圍，如果無法滿足，則應(yīng)參照CLIA′88等其他資料提供的可接受范圍或由實驗室負責(zé)人根據(jù)實驗室具體情況而定。(2)對廠家提供的兩種不同值的具有溯源性的校準品進行連續(xù)3次檢測，連續(xù)檢測5 d，其相對偏差在±15%以內(nèi)，則通過廠家聲明的驗證。(3)若廠家提供的兩種不同值的具有溯源性的校準品連續(xù)3次檢測，其相對偏差不在±15%以內(nèi)，則每種濃度增加1～2個批次檢測，將所得數(shù)據(jù)與之前的數(shù)據(jù)合并計算，增加結(jié)果的可靠程度，如其相對偏差在±15%以內(nèi)，則通過廠家聲明的驗證。

1.3.7線性范圍驗證試驗 選用廠家聲明分析測定范圍是2.44～10 000.00 pg/mL，7份線性參考品濃度分別為2.44、9.77、39.06、156.25、625.00、2 500.00、10 000.00 pg/mL，范圍包括預(yù)期的整個可檢測報告范圍。根據(jù)WS/T 408-2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南》要求[7]，所有濃度在一個批次中完成實驗。每種濃度隨機、重復(fù)測定最少2次，共得到最少14個數(shù)據(jù)，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果判斷：(1)以Grubbs法剔除離群值。(2)用Excel進行回歸方程的線性檢驗，判斷是否為非線性。(3)依照系列濃度血清的配制稀釋關(guān)系計算出各實驗樣品內(nèi)含分析物的濃度，為系列樣品的理論值。按實驗要求對系列濃度血清進行重復(fù)測定，計算均值，此值為系列濃度樣品的實測值，和理論值形成7對理論值、實測值。各份實測均值與理論值進行相關(guān)分析，偏離應(yīng)小于10%，計算Y=bX+a。

1.3.8參考區(qū)間驗證試驗 依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準化委員會(NCCLS) C28-A2文件[8]，隨機選取40例健康的男女性體檢標(biāo)本進行檢測。判斷標(biāo)準:參照C28-A2文件，先初步檢查所得的檢測數(shù)據(jù)，用1/3規(guī)則判斷數(shù)據(jù)中是否出現(xiàn)離群值，如有離群值存在必須剔除，并用其他標(biāo)本替換。判斷標(biāo)準為R值≥90%，若滿足要求，則可判定廠家提供的參考區(qū)間適用于本實驗室，若不滿足要求，則需根據(jù)本實驗室建立參考區(qū)間。按以下公式計算R值：R=檢測值在引用參考區(qū)間的個體數(shù)/總個體數(shù)×100%。

1.3.9干擾驗證試驗 在具有溯源性的校準品(濃度為625.00 pg/mL和2 500.00 pg/mL)中加入干擾物(三酰甘油、血紅蛋白和膽紅素)，分別測定2次各參考品IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ和TNF-α濃度，并計算平均值及其偏差，偏差應(yīng)在廠家提供的干擾偏差(≤10%)范圍內(nèi)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Microsoft Excel 2013軟件和SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。并計算相應(yīng)的CV和相對偏差。線性驗證中各濃度理論值與實測值關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗證試驗結(jié)果 對廠家提供的低值和高值兩種濃度的校準品進行批內(nèi)精密度和批間精密度試驗，測定結(jié)果及統(tǒng)計分析見表1。低值和高值兩種濃度的校準品連續(xù)檢測5 d，所有項目每天檢測的批內(nèi)CV均≤15%。低值和高值8項細胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-4、IL-12p70、TNF-α)的批間CV分別為(低值/高值)2.04%/4.66%、9.02%/6.35%、1.76%/4.51%、8.37%/14.39%、3.12%/5.57%、 2.41%/4.33%、5.46%/5.11%、3.75%/11.10%。由表1可見，無論是批內(nèi)CV還是批間CV，外周血細胞因子的所有項目結(jié)果均小于廠家聲明的不精密度(CV≤15%)。

表1 8項細胞因子精密度分析(%)

2.2準確度驗證試驗結(jié)果 廠家提供的兩種不同值的具有溯源性的校準品連續(xù)檢測3次，連續(xù)檢測5 d，測定結(jié)果及統(tǒng)計分析見表2。低值和高值8項細胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-4、IL-12p70、TNF-α)的批間相對偏差分別為(低值/高值)-2.61/2.99、2.85/-3.57、-3.78/2.51、0.93/-3.77、-0.78/-1.11,-4.59/-2.52、-1.53/-8.86、-0.55/-5.95。其相對偏差均在廠家聲明的±15%以內(nèi)。因此，在BDFACS Canto Ⅱ流式細胞分析儀上檢測結(jié)果的準確度符合廠家聲明的要求(偏差≤±15%)。

表2 8項細胞因子準確度分析

2.38項細胞因子線性范圍驗證試驗結(jié)果 在標(biāo)本狀態(tài)良好、無干擾的情況下，測定結(jié)果及統(tǒng)計分析見表3。已驗證8項細胞因子檢測試劑盒(多重微球流式免疫熒光發(fā)光法)在BDFACS Canto Ⅱ流式細胞分析儀上檢測結(jié)果在范圍內(nèi)呈線性，各細胞因子線性理論范圍為2.44～10 000.00 pg/mL，r2≥0.98，符合準確度要求。

表3 8項細胞因子線性范圍驗證試驗結(jié)果(pg/mL)

2.4最低檢測限驗證試驗結(jié)果 8項細胞因子檢測試劑盒(多重微球流式免疫熒光發(fā)光法)在BDFACS Canto Ⅱ流式細胞分析儀上最低檢測限符合預(yù)期，測定結(jié)果及統(tǒng)計分析見表4。IL-2的最低檢測限為0.00 pg/mL，IL-6的最低檢測限為1.47 pg/mL，IL-10的最低檢測限為1.05 pg/mL，IFN-γ的最低檢測限為0.00 pg/mL，IL-17的最低檢測限為0.56 pg/mL，IL-4的最低檢測限為1.12 pg/mL，IL-12p70的最低檢測限為0.47 pg/mL，TNF-α的最低檢測限為0.00 pg/mL。

表4 最低檢測限驗證試驗結(jié)果(pg/mL)

2.5參考區(qū)間驗證試驗結(jié)果 BD FACSCanto Ⅱ流式細胞分析儀對外周血8項細胞因子參考區(qū)間的驗證結(jié)果見表5，8項細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、TNF-α)的R值分別為95.0%、97.5%、92.5%、97.5%、100.0%、97.5%、95.0%、92.5%，廠家提供的參考區(qū)間均≥90.0%，適合本實驗室。

表5 外周血細胞因子參考區(qū)間驗證試驗結(jié)果

2.6干擾驗證試驗結(jié)果 在干擾物三酰甘油≤10 mmol/L、血紅蛋白≤5.0 mg/mL、膽紅素≤258 μmol/L時，干擾偏差小于或等于廠家提供的10%偏差范圍。

3 討 論

細胞因子是由多種組織細胞合成和分泌的小分子蛋白質(zhì)，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，具有多種生物學(xué)功能，如參與細胞生長分化和成熟的調(diào)控，以及免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)等過程[9-10]。流式細胞術(shù)具有高速、高精度、高準確度的優(yōu)點，能夠?qū)ι先f個細胞進行高速分析，獲取每個細胞的多種參數(shù)特征，從而在細胞分子濃度上應(yīng)用單克隆抗體對單個細胞或單個分子進行多參數(shù)、快速的定量分析[11]。

一般來說，科室對于送檢標(biāo)本通常只進行一次檢測，這必然要求檢驗方法應(yīng)該具有良好的精密度。本研究中無論是低濃度還是高濃度的參考品，應(yīng)用多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測外周血細胞因子各項指標(biāo)的批內(nèi)精密度結(jié)果和批間精密度結(jié)果均滿足廠家聲明的精密度要求，說明本實驗方法具有較高的重復(fù)性與精密度。

準確度是指某一指標(biāo)多次檢測的平均值和真實值相一致的程度。目前，進行準確度驗證的方法有很多種，本實驗室使用廠家提供的校準品作為參考物質(zhì)，用來驗證多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測結(jié)果的準確度和穩(wěn)定性。通過檢測參考物質(zhì)并對參考物質(zhì)的賦值進行對比，從而計算得到實驗室參考物質(zhì)的測量偏移值和賦值的不確定度。本實驗準確度檢測結(jié)果中所有外周血細胞因子檢測項目的實驗室參考物質(zhì)測量偏移值均小于或等于其所對應(yīng)的參考物質(zhì)賦值的不確定度，因此，可認為該方法的準確度性能符合要求。

線性范圍是待測物質(zhì)的變化范圍，對應(yīng)于校準曲線的直線部分。依據(jù)廠家提供的信息，多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測外周血細胞因子的濃度范圍為2.44～10 000.00 pg/mL。在驗證線性范圍時，實驗室應(yīng)在廠家聲明的線性范圍內(nèi)取5～7種濃度的標(biāo)本，所測標(biāo)本濃度間隔應(yīng)盡可能保持一致。本研究選取了7種不同濃度的標(biāo)本作為本研究的線性范圍檢測對象，根據(jù)針對各項細胞因子檢測結(jié)果所繪制的線性回歸圖與差異圖發(fā)現(xiàn)，本實驗方法測量的線性范圍基本符合廠家所提供的線性范圍，說明該儀器具有良好的線性范圍。

按照NCCLS C28-A2文件推薦的方法，對外周血細胞因子的參考區(qū)間進行方法學(xué)驗證，測定結(jié)果提示，IL-2有95.0%的測定數(shù)據(jù)在廠家引用的參考區(qū)間內(nèi)，IL-4為97.5%、IL-6為92.5 %、IL-10為97.5%、IL-12p70為100.0%、IL-17為97.5%、IFN-γ為95.0%、TNF-α為92.5%，均大于90.0%的要求，表明廠家提供的參考區(qū)間適合本實驗室，故可以直接引用。但值得注意的是，廠家提供的參考區(qū)間是對192例健康人群血清或血漿標(biāo)本進行研究，廠家提供的這些參數(shù)可能會受患者性別、年齡、種族等因素的影響，所以，必要時實驗室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間。

干擾物的存在常常是引起臨床實驗室檢測項目誤差的重要來源之一，因此，對常規(guī)臨床實驗室定量檢測項目進行抗干擾評價極其重要。本研究中8項細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、TNF-α)對三酰甘油、血紅蛋白和膽紅素的抗干擾能力均符合廠家所提供的偏差范圍要求。干擾試驗反映了流式細胞術(shù)在檢測細胞因子方面對于三酰甘油、血紅蛋白和膽紅素的抗干擾能力較強，保證了結(jié)果的準確度，在一定程度上降低了實驗室對待檢標(biāo)本的要求，易于患者留樣待檢。

綜上所述，多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測外周血細胞因子的方法學(xué)性能良好，該方法的精密度、準確度、線性范圍、最低檢測限、參考區(qū)間和抗干擾能力均符合廠家要求，可為臨床診斷提供準確和可信的檢測結(jié)果。