李偉業(yè) 徐志進(jìn) 殷小龍 陳 爽 馬雪彬 章 霞 邱豪軍 張曉林 蔣霞敏

溫度對美洲黑石斑()幼魚生長和免疫因子活力與相關(guān)基因表達(dá)的影響*

李偉業(yè)1, 2徐志進(jìn)2殷小龍2陳 爽2馬雪彬2章 霞2邱豪軍2張曉林3蔣霞敏1①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315832; 2. 浙江省舟山市水產(chǎn)研究所 舟山 316000; 3. 浙江海洋大學(xué) 舟山 316022)

采用溫度漸變的方法, 研究了18、22、26、30 °C共4個(gè)溫度梯度對美洲黑石斑幼魚[(73.74±3.76)g]生長及免疫因子活力的影響。結(jié)果表明, 溫度對美洲黑石斑幼魚的生長和存活均有不同程度的影響。在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi), 隨著溫度的升高, 美洲黑石斑幼魚最終體重、特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增重率(GBW)和增長率(GBL)均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 且部分溫度組間差異顯著(<0.05), 其中上述各項(xiàng)指標(biāo)中, 溫度22 °C組均最高, 與溫度26 °C組差異不顯著(>0.05), 而與溫度18 °C、30 °C組存在顯著性差異(<0.05); 幼魚的飼料系數(shù)(FCR)隨溫度升高先降低后升高, 且部分溫度組間差異顯著(<0.05)。在成活率方面, 除溫度30 °C組的成活率為82.2%, 顯著低于其他溫度組外(<0.05), 其他各溫度組成活率均達(dá)到90%以上。溫度對美洲黑石斑幼免疫相關(guān)酶活力和基因表達(dá)也存在一定影響。在實(shí)驗(yàn)第1 d時(shí), 堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力隨溫度的升高呈逐漸升高的趨勢, 而在實(shí)驗(yàn)第60 d時(shí), 堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢, 且22 °C和26 °C組顯著高于18 °C和30 °C組(<0.05); 而超氧化物歧化酶(SOD)活力在實(shí)驗(yàn)第1 d時(shí)隨溫度的升高呈先下降后升高的趨勢, 實(shí)驗(yàn)第60 d時(shí)超氧化物歧化酶(SOD)活力隨溫度的升高逐漸上升。溫度也影響和基因的表達(dá), 盡管實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組和基因的表達(dá)變化未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性, 但30 °C組和的表達(dá)量顯著高于其他組(<0.05)。從以上結(jié)果可見, 溫度對美洲黑石斑幼魚的生長和免疫因子活力有一定影響, 綜合實(shí)驗(yàn)魚的生長和免疫因子實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 美洲黑石斑幼魚最適的生長溫度應(yīng)為22—26 °C。

溫度; 美洲黑石斑; 生長; 免疫酶; HSP70; HSP90

美洲黑石斑(), 又稱條紋鋸鮨和黑鋸鮨, 通稱黑石斑, 商品名為翡翠斑或珍珠斑, 屬鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Serraninae)、鋸鮨屬(), 原產(chǎn)于墨西哥灣水域、美國東岸及加拿大東南近海(雷霽霖等, 2007)。因其肉質(zhì)豐腴、口感清爽, 適應(yīng)性強(qiáng)、且易于接受配合飼料、養(yǎng)殖生長速度要比自然界快, 因此備受養(yǎng)殖界青睞, 美國水產(chǎn)養(yǎng)殖界將其定位為高價(jià)值魚類和美洲杰出的候選養(yǎng)殖品種(盧繼武等, 2006; 雷霽霖等, 2007)。從20世紀(jì)70年代開始, 國外相繼對美洲黑石斑的地理分布、生物學(xué)特性、生殖習(xí)性等方面進(jìn)行研究(Kendall, 1977; Link, 1980), 隨后開展了美洲黑石斑繁育養(yǎng)殖方面的研究, 并發(fā)現(xiàn)在人工養(yǎng)殖條件下, 其生長速度比自然棲息地的魚快許多倍, 認(rèn)為養(yǎng)殖優(yōu)勢和市場優(yōu)勢非常突出, 養(yǎng)殖潛力巨大, 值得大力推廣(Kim, 1987; Tucker, 1989)。國內(nèi)在美洲黑石斑增養(yǎng)殖方面的研究起步稍晚, 首先由青島三高大菱鲆研究所有限公司于2003年從美國東北沿岸引進(jìn)美洲黑石斑魚苗, 開啟了美洲黑石斑增養(yǎng)殖研究的序幕, 并于2006年取得苗種規(guī)?；庇某晒? 為我國美洲黑石斑養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)(王波等, 2003; 雷霽霖等, 2007)。目前, 美洲黑石斑已在我國溫帶海域, 尤其是浙江、福建海區(qū)開展了池塘、網(wǎng)箱、工廠化養(yǎng)殖(褚衍偉, 2004)。

溫度是養(yǎng)殖水環(huán)境中重要的環(huán)境因子, 不僅影響水生動(dòng)物的生長、發(fā)育和存活等, 還能顯著影響其免疫系統(tǒng)(An, 2010)。不適的溫度條件不僅抑制水生動(dòng)物的生長, 也會(huì)破壞其免疫系統(tǒng), 從而引發(fā)疾病, 造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重?fù)p失(Wyban, 1995; Le Moullac, 2000)。國內(nèi)外學(xué)者在魚類方面開展了廣泛的研究, 諸多研究表明溫度對魚類的生長、存活和抗病力均會(huì)產(chǎn)生顯著的影響(Mart??nez-Palacios, 2002; Partridge, 2002; 李文龍等, 2017)。同樣, 在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 溫度對美洲黑石斑的生長、疾病也存在顯著的影響, 在15—30 °C下表現(xiàn)出較好的生長性能, 但在高溫養(yǎng)殖環(huán)境下又極易染病。然而, 目前關(guān)于溫度對美洲黑石斑的生長和免疫因子的研究鮮見報(bào)道。因此, 本文在15—30 °C范圍內(nèi)選取了4個(gè)不同的溫度, 研究美洲黑石斑幼魚的生長、免疫相關(guān)酶活力及、基因表達(dá)的影響, 以期探究出美洲黑石斑適宜的養(yǎng)殖溫度, 為美洲黑石斑的健康養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年6—8月, 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在浙江省舟山市水產(chǎn)研究所朱家尖基地。實(shí)驗(yàn)用魚為人工繁育的美洲黑石斑幼魚, 挑選健康、活力強(qiáng)、無畸形、大小相近, 體重(73.74±3.76) g, 體長(14.06±0.13) cm的美洲黑石斑幼魚, 放于恒溫實(shí)驗(yàn)房的圓形實(shí)驗(yàn)桶內(nèi), 實(shí)驗(yàn)桶規(guī)格為直徑80 cm、高100 cm。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)消毒沉沙濾后的自然海水, 實(shí)驗(yàn)期間, 每天換水2次, 日換水率50%, 每天投喂2次配合飼料(天邦海水魚配合飼料3號料), 投喂時(shí)間為09:00和16:00, 并于投喂后1 h吸污清底。水質(zhì)條件為: 鹽度26—28, pH 8.4±0.1, 氨氮<0.3 mg/L, 亞硝酸鹽<0.1 mg/L, 溶解氧保持在5 mg/L以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)設(shè)18、22、26、30 °C四個(gè)溫度梯度組, 每個(gè)溫度梯度設(shè)3個(gè)平行, 各實(shí)驗(yàn)桶放30尾實(shí)驗(yàn)魚。實(shí)驗(yàn)開始前, 將實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)桶進(jìn)行暫養(yǎng), 暫養(yǎng)水溫24 °C, 暫養(yǎng)7 d后按照1 °C/d升溫或降溫, 至各溫度梯度后, 開始實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行60 d。

實(shí)驗(yàn)期間, 觀察并記錄實(shí)驗(yàn)魚的日常行為狀態(tài), 并在實(shí)驗(yàn)第1 d和第60 d測量魚的體重、全長, 統(tǒng)計(jì)成活率; 再從各梯度組中隨機(jī)取3尾魚, 取血清和肝臟, 用于相關(guān)酶活力和基因表達(dá)測定。

1.2.2 樣品制備 從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)取3尾魚, 用MS-222麻醉后, 用一次性注射器(1 mL)從美洲黑石斑幼魚尾靜脈取血, 血液置于1.5 mL離心管中, 4 °C下靜置4 h后, 以12000 r/min離心30 min, 取上清液, 即為血清樣品。剪取魚肝臟, 用預(yù)冷蒸餾水洗凈, 濾紙吸干, 置于1.5 mL離心管中, 迅速液氮冷凍。所取樣品均置于冰箱(–80 °C)中, 用于酶活和基因檢測。

1.2.3 酶活測定 使用購自南京建成生物工程研究所試劑盒測定樣品酶活力。堿性磷酸(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活力采用微量酶標(biāo)法, 活力單位為U/L; 溶菌酶(LSZ)活力采用比濁法測定, 活力單位為U/mL; 超氧化物歧化酶(SOD)活力采用比色法, 活力單位為U/mL。

1.2.4 基因表達(dá)檢測 使用RNA提取試劑盒(天根)提取總RNA, 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa), 按說明步驟合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中、基因序列, 使用primer 5.0設(shè)計(jì)兩對特異性引物(表1)。用于熒光定量分析(qPCR), 選取作為內(nèi)參基因(黃左安等, 2011)。使用TransStart Top Green qPCR Super Mix試劑盒(全式金)試劑盒對cDNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7300plus)上進(jìn)行檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)期間美洲黑石斑幼魚特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增長率(GBL)、增重率(GBW)、飼料系數(shù)(FCR)計(jì)算如下:

SGR=[(ln2–ln1)/]×100%, (1)

DWG=(2–1)/, (2)

GBL=(2–1)/1×100%, (3)

GBW=(2–1)/1×100%, (4)

FCR=/[(2–1)], (5)

式中,1、2為時(shí)間1、2時(shí)的體重(g);1、2為時(shí)間1、2時(shí)的全長(cm);為實(shí)驗(yàn)天數(shù);為實(shí)驗(yàn)個(gè)體尾數(shù);為總投餌量(g)。

表1 美洲黑石斑基因定量分析所用引物

Tab.1 Primers that were used in the q-PCR an alysis of C. striata

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析, 用Duncan氏和T檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析和多重比較, 數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±S.D.)表示,<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 溫度對美洲黑石斑幼魚行為狀態(tài)的影響

由表2可以看出, 不同溫度下美洲黑石斑幼魚的游動(dòng)、攝食等行為狀態(tài)相似。18、22和26 °C組的幼魚活力強(qiáng), 游動(dòng)迅捷, 攝食兇猛, 搶食明顯, 多分布于水體下層; 而30 °C組幼魚活力和攝食均一般, 分布于水體各層。實(shí)驗(yàn)期間, 實(shí)驗(yàn)魚的成活率較高, 除30 °C組的成活率為82.2%外, 顯著低于其他組(<0.05), 其他組的成活率均高于90%。

2.2 溫度對美洲黑石斑幼魚生長的影響

由表3可見, 美洲黑石斑幼魚的最終體重、最終體長、特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增長率(GBL)和增重率(GBW)隨溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。且部分溫度組間差異顯著(<0.05), 其中22 °C組最終體重、特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增長率(GBL)和增重率(GBW)均最大, 與26 °C組差異不顯著(0.05), 而與溫度18 °C、30 °C組存在顯著性差異(<0.05); 而溫度30 °C組的上述各項(xiàng)指標(biāo)均最低, 與18 °C組差異不顯著(0.05), 但與22 °C和26 °C組差異顯著(<0.05)。美洲黑石斑幼魚的飼料系數(shù)(FCR)隨溫度升高呈先降低后升高的趨勢, 且部分溫度組間差異顯著(<0.05), 30 °C組的飼料系數(shù)()最高為1.835±0.044, 22 °C組的飼料系數(shù)()最低為1.443±0.033。

2.3 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的AKP活力變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的AKP活力見圖1。由圖1可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的AKP活力隨溫度的升高逐漸升高, 30 °C組最高為(28.42±0.99) U/L, 顯著高于其他組(0.05), 18 °C最低為(19.59±0.99) U/L, 顯著低于其他組(0.05), 而22 °C和26 °C兩組間差異不顯著(0.05)。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的AKP活力隨溫度的升高呈先升高后下降的趨勢, 26 °C組最高為(26.26±1.04) U/L, 且與22 °C組差異不顯著(0.05)。18 °C和30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的AKP活力均低于實(shí)驗(yàn)第1 d, 且存在顯著性差異(0.05); 而22 °C和26 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的AKP活力均高于第1 d, 但差異不顯著(0.05)。

2.4 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的ACP活力變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的ACP活力見圖2。由圖2可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的ACP活力隨溫度的升高逐漸升高, 30 °C組最高為(18.21±0.83) U/L, 顯著高于18 °C和22 °C組(<0.05), 18 °C最低為(14.63±0.60) U/L, 顯著低于其他組(<0.05), 而22 °C和26 °C兩組間差異不顯著(>0.05)。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的ACP活力隨溫度的升高呈先升高后下降的趨勢, 26 °C組最高為(16.70±0.62) U/L, 且與22 °C組差異不顯著(>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組第60 d的ACP活力均低于實(shí)驗(yàn)第1 d, 其中18 °C和30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的ACP活力顯著低于第1 d (<0.05); 而22 °C和26 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的ACP活力與第1 d差異不顯著(>0.05)。

表2 不同溫度下美洲黑石斑幼魚的行為狀態(tài)

Tab.2 The performance of juvenile C. striata in different temperatures

注: 同一列數(shù)據(jù)中上標(biāo)字母不同表示顯著差異(<0.05)

表3 不同溫度下美洲黑石斑幼魚的生長指標(biāo)

Tab.3 Indicators to the growth of juvenile C. striata in different temperatures

注: 同一行數(shù)據(jù)中上標(biāo)字母不同表示顯著差異(<0.05)

圖1 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的AKP活力

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(0.05)

圖2 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的ACP活力

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(0.05)

2.5 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力見圖3。由圖3可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力隨溫度的升高逐漸升高, 且各組間存在顯著性差異(<0.05), 其中30 °C組最高為(202.85±4.00) U/mL, 18 °C組最低為(163.47±1.93) U/mL。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力隨溫度的升高呈先升高后下降的趨勢, 26 °C組最高為(169.82±2.26) U/mL, 與其他組差異顯著(<0.05)。18 °C和22 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的LSZ活力均高于實(shí)驗(yàn)第1 d, 但差異不顯著(>0.05); 而26 °C和30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的LSZ活力均低于第1 d, 其中26 °C組差異不顯著(>0.05), 而30 °C組存在顯著性差異(<0.05)。

圖3 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(0.05)

2.6 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力見圖4。由圖4可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力隨溫度的升高呈先下降后上升的趨勢, 30 °C組最高為(174.44±1.25) U/mL, 顯著高于其他組(<0.05), 22 °C組最低為(152.89±0.60) U/mL, 顯著低于其他組(<0.05)。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力隨溫度的升高逐漸上升, 30 °C組最高, 為(195.54±4.21) U/mL, 且顯著高于其他組(<0.05); 18 °C組最低, 為(145.48±2.76) U/mL, 且顯著低于其他組(<0.05)。22、26和30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的SOD活力均高于實(shí)驗(yàn)第1 d, 其中30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的SOD活力顯著高于第1 d (<0.05), 而22 °C和26 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的SOD活力與第1 d差異不顯著(>0.05)。18 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的SOD活力均低于實(shí)驗(yàn)第1 d, 且存在顯著性差異(<0.05)。

圖4 不同溫度下美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(<0.05)

2.7 不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中HSP70基因的表達(dá)量變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中基因的表達(dá)量見圖5。由圖5可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚肝臟中基因的表達(dá)量隨溫度的升高呈逐漸上升的趨勢, 30 °C組最高, 且與其他組差異顯著(<0.05)。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚肝臟中基因的表達(dá)量隨溫度的升高呈先下降后上升的趨勢, 其中30 °C組顯著高于其他組(<0.05), 而22 °C組顯著低于其他組(<0.05)。18、22和26 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的基因的表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)第1 d, 且各組差異顯著(<0.05), 而30 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的基因的表達(dá)量低于第1 d, 但差異不顯著(>0.05)。

圖5 不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中的HSP70基因的相對表達(dá)量

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(0.05)

2.8 不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中HSP90基因的表達(dá)量變化

不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中基因的表達(dá)量見圖6。由圖6可知, 實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑肝臟中基因的表達(dá)量隨溫度的升高呈逐漸上升的趨勢, 30 °C組最高, 且與其他組差異顯著(<0.05)。實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚肝臟中基因的表達(dá)量隨溫度的升高也呈先下降后上升的趨勢, 其中30 °C組顯著高于其他組(<0.05), 而22 °C組顯著低于其他組(<0.05)。22 °C和26 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的基因的表達(dá)量均低于實(shí)驗(yàn)第1 d, 且各組差異顯著(<0.05), 而18 °C組實(shí)驗(yàn)第60 d的基因的表達(dá)量高于第1 d, 但差異不顯著(>0.05)。

3 討論

3.1 魚類適宜溫度的因子篩選

溫度是影響魚類最重要的環(huán)境因素之一, 它能直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物的新陳代謝、生長和存活, 同樣也對魚類的免疫機(jī)能和抗病能力有顯著影響(Imsland, 1996; An, 2010)。探究出魚類適宜的溫度范圍對提升魚類生長速度、有效預(yù)防病害發(fā)生、提升養(yǎng)殖效益具有顯著的作用(雷霽霖等, 2007)。研究人員在探尋魚類生長適溫方面做了大量的研究工作, 主要從魚類的表型性狀、生理生化指標(biāo)及基因表達(dá)變化等方面進(jìn)行了研究。魚類的生長性能、攝食和存活情況可直觀反映自身的生存狀態(tài), 因此研究人員多通過上述指標(biāo)探尋魚類的適溫范圍, 如大菱鲆()、大瀧六線魚()、點(diǎn)籃子魚()、斑點(diǎn)叉尾()等(Buentello, 2000; 高淳仁等, 2006; 胡發(fā)文等, 2012; 劉鑒毅等, 2015)。魚類的自身狀態(tài)從生理指標(biāo)的變化也可以體現(xiàn), 如研究人員對軍曹魚()、施氏鱘()、大菱鲆()通過研究抗氧化酶、消化酶、免疫相關(guān)酶的活力變化探尋魚類的適宜生長溫度(楊健, 2007; 白海文, 2012; 李文龍等, 2017)。諸多研究人員也通過基因表達(dá)的變化探尋魚類適溫范圍, 如研究人員通過對大西洋鮭()的基因、布氏鯧鯵() GHRHR基因、黃姑魚()基因在不同溫度條件下的表達(dá)變化, 探究魚類基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)。可見, 通過研究表型性狀、生理生化指標(biāo)和基因等因子變化, 可有效了解魚類的生存狀態(tài), 從而探尋出魚類的適溫范圍。

圖6 不同溫度下美洲黑石斑幼魚肝臟中的HSP90基因的相對表達(dá)量

注: 圖中不同小寫字母代表同一時(shí)間下不同溫度組間的表達(dá)差異(0.05), 不同大寫字母代表同一溫度組不同時(shí)間下的表達(dá)差異(0.05)

3.2 溫度對美洲黑石斑幼魚生長的影響

適宜的水溫變化對魚類生長促進(jìn)作用, 一定范圍內(nèi)升溫有利于魚類的生長發(fā)育, 而水溫超過適宜溫度后, 則往往會(huì)抑制魚類的生長, 同時(shí)也會(huì)對攝食、成活造成影響(王小磊, 2001; 高淳仁等, 2006)。研究人員在溫度對魚類的影響方面已開展了大量的研究工作, 并發(fā)現(xiàn)溫度變化對魚類的生長性能有顯著的影響。劉鑒毅等(2015)對點(diǎn)籃子魚()的研究發(fā)現(xiàn), 在19—31 °C范圍內(nèi)幼魚的特定生長率(SGR)和相對增重率(WGR)隨溫度的升高而顯著增加, 攝食率(FR)隨著溫度的升高而顯著升高(<0.05), 認(rèn)為點(diǎn)籃子魚幼魚快速生長的適宜溫度范圍為29.89—31.74 °C。胡發(fā)文等(2012)對大瀧六線魚()的研究結(jié)果表明, 溫度變化對大瀧六線魚4月齡幼魚存活與生長的影響顯著(<0.05), 4月齡幼魚存活與生長適宜水溫為14—23 °C, 最適水溫為17—23 °C, 在適溫范圍內(nèi)幼魚具有較高的存活率和生長率, 溫度過高或過低均對其生長發(fā)育有抑制作用。高淳仁等(2006)研究發(fā)現(xiàn)不同溫度對大菱鲆()幼魚生長、成活率具有顯著影響, 結(jié)果表明, 12—16 °C時(shí), 其生長速度隨溫度的升高而加快, 且在此溫度范圍內(nèi)攝食、生長較好, 成活率高也不易染病。曾本和等(2018)研究了水溫對異齒裂腹魚()存活、攝食和生長的影響, 結(jié)果表明水溫與飼料系數(shù)、體質(zhì)量增長率、體長增長率、特定生長率均為拋物線關(guān)系, 異齒裂腹魚幼魚在12—22 °C水溫范圍內(nèi)均可存活、攝食及生長, 最適溫度15.15—17.24 °C。李勇等(2011)研究發(fā)現(xiàn)高密度封閉循環(huán)海水養(yǎng)殖條件下大菱鲆攝食、生長和消化的適宜溫度范圍為16—18 °C, 適溫范圍內(nèi)的最大攝食率為0.52%—0.55%。Buentello等(2000)研究發(fā)現(xiàn), 斑點(diǎn)叉尾()的最適生長水溫為22.8 °C, 在該溫度下攝食量和飼料轉(zhuǎn)化效率最高。從上述的研究可以看出, 溫度的變化對魚類生長、攝食和存活有顯著的影響。本研究結(jié)果顯示, 不同溫度對美洲黑石斑幼魚的生長影響顯著(<0.05), 在溫度18—30 °C范圍內(nèi), 美洲黑石斑的最終體重、最終體長、特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增長率(GBL)和增重率(GBW)隨溫度的升高呈先升高后降低的趨勢, 其中22 °C組最終體重、特定增長率(SGR)、日增重(DWG)、增長率(GBL)和增重率(GBW)均最大, 而溫度30 °C組的上述各項(xiàng)指標(biāo)均最低。美洲黑石斑的飼料系數(shù)(FCR)隨溫度升高呈先降低后升高的趨勢, 且部分溫度組間差異顯著(<0.05), 22 °C組的飼料系數(shù)(FCR)最小, 30 °C組的飼料系數(shù)(FCR)最大。在18—26 °C范圍內(nèi), 美洲黑石斑的成活率達(dá)90%以上。這表明, 美洲黑石斑在18—30 °C范圍內(nèi)均能生長存活, 而在22—26 °C范圍內(nèi)的生長性能最好。

3.3 溫度對美洲黑石斑幼魚免疫相關(guān)酶活力的影響

溫度不僅影響魚類的生長, 對其免疫功能也有顯著的影響(Bly, 1992)。諸多研究表明, AKP、ACP、LSZ和SOD等酶是魚類免疫防御體系中重要的酶, 可反映出魚類機(jī)體的免疫狀態(tài)(陳昌福等, 1990; M?ck, 1990)。

AKP和ACP是魚類免疫防御體系中比較重要的水解酶, 也是重要的代謝調(diào)控酶, 在防御異物侵入的機(jī)制中直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝, 形成水解酶體系, 在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用(Muta, 1996; Yokota, 1982)。目前, 有關(guān)溫度度變化對魚類AKP和ACP活力的影響已研究較多。研究人員對大菱鲆(Huang, 2011)、草魚()(張繼平等, 2005)、施氏鱘()(劉紅柏, 2004)、花()(方美娟等, 2010)、羅非魚()(強(qiáng)俊等, 2012)等魚類的研究發(fā)現(xiàn), 溫度對AKP和ACP的活力有顯著影響, 且均隨水溫呈先升高后降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的AKP和ACP活力與上述研究結(jié)果一致, 隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢, 而實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的AKP和ACP活力呈逐漸升高的趨勢。這可能在實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 受溫度的影響, 美洲黑石斑幼魚血清中的AKP和ACP的活力隨著溫度的升高出現(xiàn)短暫的活力增強(qiáng), 以提升自身的免疫力; 而當(dāng)美洲黑石斑幼魚長期處于高溫下, 由于其免疫能力的下降, 血清中的AKP和ACP活力也降低。同時(shí), 實(shí)驗(yàn)第60 d, 美洲黑石斑幼魚AKP和ACP的活力在22 °C組和26 °C組顯著高于18 °C組和30 °C組, 這也表明, AKP和ACP的活力在適宜的溫度下活力最強(qiáng), 溫度過低或過高都會(huì)使AKP和ACP的活力降低, 致使實(shí)驗(yàn)魚免疫力下降。

LSZ是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ), 對機(jī)體的抗炎、修復(fù)和再生等過程中具有重要作用, 溶菌酶(LSZ)活力是衡量水生動(dòng)物免疫狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)(M?ck, 1990)。溫度對魚類機(jī)體內(nèi)LSZ的變化有顯著的影響, 研究人員對大西洋庸鰈(L.) (Langston, 2002)、草魚(陳昌福等, 1990; 楊先樂等, 1997)、虹鱒() (向建國等, 2008)的研究發(fā)現(xiàn), 在適宜范圍內(nèi), LSZ活力隨溫度的升高而升高, 超過適宜溫度, LSZ活力有下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力與上述研究結(jié)果一致, 隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢, 而實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ活力呈逐漸升高的趨勢。這可能在實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 在高溫刺激下, 美洲黑石斑幼魚血清中的LSZ的活力增強(qiáng), 以提升自身的免疫力, 這也與Huang對大菱鲆的研究結(jié)果一致(Huang, 2011); 而實(shí)驗(yàn)第60 d的研究結(jié)果表明, 當(dāng)美洲黑石斑幼魚長期處于不適的溫度下, 由于其免疫能力的下降, LSZ活力也降低。

SOD是魚類機(jī)體重要的抗氧化酶, 可有效清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基, 在提升吞噬細(xì)胞防御能力和機(jī)體免疫功能中發(fā)揮重要作用, 通過檢測 SOD的活力能夠比較準(zhǔn)確地反映機(jī)體內(nèi)自由基的代謝及組織的氧化損傷情況(Nichols, 2000; 覃川杰等, 2011)。目前, 有關(guān)溫度變化對魚類SOD酶活力的影響已研究較多, 而不同魚類SOD酶活力的變化情況卻不盡相同。對大菱鲆(Huang, 2011; 李文龍等, 2017)、羅非魚() (強(qiáng)俊等, 2012)、褐牙鲆() (徐冬冬等, 2010)等魚類的研究發(fā)現(xiàn), SOD活力隨溫度的升高先上升后下降; 而對軍曹魚() (楊健等, 2007)、金魚() (Lushchak, 2006)、大彈涂魚() (Liu, 2006)等魚類的研究發(fā)現(xiàn), SOD活力隨溫度的升高先逐漸上升。本研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)第60 d美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力與后者研究結(jié)果一致, 隨溫度升高逐漸上升, 而實(shí)驗(yàn)第1 d美洲黑石斑幼魚血清中的SOD活力呈先下降后升高的趨勢。這可能在實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 實(shí)驗(yàn)魚為適應(yīng)溫度的變化, 通過提升SOD活力, 增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)性。而實(shí)驗(yàn)第60 d的不同溫度組實(shí)驗(yàn)魚的SOD變化趨勢, 可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi), 美洲黑石斑幼魚的耗氧率隨環(huán)境溫度的升高而升高, 氧自由基的產(chǎn)生也隨之增加, 機(jī)體SOD活力的增強(qiáng)可降低氧化氫, 從而消除氧化損傷。

3.4 溫度對美洲黑石斑幼魚免疫相關(guān)基因的影響

是生物機(jī)體內(nèi)的一種分子伴侶, 調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能, 提高細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)的耐受性, 避免生物體遭受氧化應(yīng)激傷害, 常作為反映機(jī)體細(xì)胞功能態(tài)和抗應(yīng)激能力的指標(biāo)之一(Bond, 1987; Parsell, 1993)。和是重要的家族成員(馮起國, 1998)。諸多研究表明溫度變化對魚類機(jī)體內(nèi)的表達(dá)具有顯著的影響, 如研究人員對大西洋鮭() (Takle, 2005)、西伯利亞鱘() (田照輝等, 2013)、鯉魚() (王云彪, 2008)、黃姑魚((羅勝玉, 2016)等研究發(fā)現(xiàn), 在溫度急性刺激下,或基因均有顯著的變化。但上述研究, 多為短時(shí)間的溫度刺激, 而長時(shí)間實(shí)驗(yàn)對象的養(yǎng)殖條件下的研究報(bào)道鮮見。本研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)第0 d和第60 d, 各實(shí)驗(yàn)組美洲黑石斑幼魚的和基因的表達(dá)變化未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性, 但30 °C組美洲黑石斑幼魚的和基因的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)第0 d和第60 d均顯著高于其他組, 表明美洲黑石斑幼魚在30 °C條件下機(jī)體反應(yīng)強(qiáng)烈, 通過提高和基因的表達(dá)量, 以提升自身的抗高溫能力, 但和基因長時(shí)間的上調(diào)表達(dá)耗能巨大, 導(dǎo)致美洲黑石斑幼魚免疫力下降, 也致使成活率降低, 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, 也發(fā)現(xiàn)30 °C組實(shí)驗(yàn)魚的成活率最低。這與周鑫等(2013)對草魚的研究結(jié)果較為一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 溫度對美洲黑石斑幼魚的生長和免疫因子活力均有一定的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)魚的生長和免疫因子實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 結(jié)合美洲黑石斑幼魚的實(shí)際生活環(huán)境, 本文作者認(rèn)為美洲黑石斑幼魚最適的生長溫度應(yīng)為22—26 °C。

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EFFECTS OF TEMPERATURE ON GROWTH, IMMUNE FACTOR ACTIVITY AND RELATED GENE EXPRESSION OF JUVENILE

LI Wei-Ye1, 2, XU Zhi-Jin2, YI Xiao-Long2, CHEN Shuang2, MA Xue-Bin2, ZHANG Xia2, QIU Hao-Jun2, ZHANG Xiao-Lin3, JIANG Xia-Min1

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2. Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316000, China; 3.Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Using the temperature gradient method, we studied The effects of temperature gradients of 18, 22, 26, and 30 °C on growth and immune factor activity of juvenile[(73.74±3.76) g]. The results indicate that temperature affected the growth and survival of the juveniles in a different degree. With the increase of temperature, the final body weight, final body length, specific growth rate (SGR), daily weight gain (DWG), weight gain rate (GBW) and growth rate (GBL) of the juvenile fish showed a trend of first increasing and then decreasing, but significant differences were shown among groups (<0.05). The 22 °C group showed the best performance in all the above indicators so did similarly in group at 26 °C, but the 18 °C and 30 °C groups. The feed coefficient of juveniledecreased first and then increased with the increase of temperature, and the among-group difference was significant (<0.05). In survival rate, the 30 °C group was the lowest (82.2%), which was significantly lower than those of other groups were (<0.05) (>90%). Temperature had also a certain effect in terms of the activity of immune-related enzymes and gene expression in the juveniles. The activities of alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LSZ) gradually increased with the temperature on the 1th Day of the experiment, and first increased and then decreased with the temperature increasing on the 60th day of the experiment. Moreover, the above-mentioned activities in 22 °C and 26 °C groups were significantly higher than those in 18 °C and 30 °C groups (<0.05). The activity of superoxide dismutase (SOD) decreased first and then increased with the increase of temperature on the 1th day of the experiment, and gradually increased with the increase of temperature on the 60th day of the experiment. Temperature also affected the expressions ofand. Although the expressions in each experimental group did not show obvious regularity, the expression levels in the 30 °C group were significantly higher than those in other groups (<0.05). Therefore, temperature affected obviously the growth and immune factor activity of juvenile. The experimental data show that the optimal growth temperature of juvenilewas 22—26 °C.

temperature;; growth; immune enzyme;;

* 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2019C02048號; 舟山市公益類科技項(xiàng)目, 2019C31053號。李偉業(yè), 博士研究生, E-mail: 17536260@qq.com

蔣霞敏, 博士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: jiangxiamin@nbu.edu.cn

2020-09-25,

2020-10-22

S965.329

10.11693/hyhz20200900257