曹鳳儀，馬港慶，秦 琦，梅 林，朱根興

(中原工學(xué)院材料與化工學(xué)院，河南 鄭州 450007)

當(dāng)有害微生物入侵人體時(shí)，會在人體內(nèi)繁殖并導(dǎo)致感染性疾病如肺炎、腸炎、骨髓炎、腦膜炎等的發(fā)生[1]。目前，針對這類疾病臨床最廣泛的治療方法是使用抗生素類藥物，然而由于抗生素的廣泛和不規(guī)范使用，導(dǎo)致了大量耐藥菌和超級細(xì)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅人類健康[2]，迫切需要研究者開發(fā)新型抗菌藥物來抵御耐藥菌和超級細(xì)菌。

抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗菌藥物，目前已知的可以從生物體內(nèi)提取的抗菌肽超過2 817種[3-4]，然而天然抗菌肽存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、提純難度大等問題。隨著科技的發(fā)展，人工合成技術(shù)已成為一種新型的開發(fā)和研制抗菌肽的方法[5-8]。人工合成抗菌肽通常以天然抗菌肽中活性多肽序列為基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽通常富含疏水性氨基酸殘基，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等；并含有大量的陽離子氨基酸，使抗菌肽具有2～9個正電荷。此外，這種兩親性結(jié)構(gòu)對抗菌肽的抗菌性能至關(guān)重要[5]。

PAF26抗菌肽是由6個氨基酸組成的具有抗菌性能的兩親性多肽。據(jù)報(bào)道，PAF26多肽具有優(yōu)異的抗菌性能，并且不會溶解和破壞人體細(xì)胞[9-10]。因此，作者以PAF26多肽為基礎(chǔ)，在多肽序列中引入堿性氨基酸，同時(shí)引入相應(yīng)數(shù)量的苯丙氨酸，設(shè)計(jì)了4個堿性氨基酸-PAF26衍生多肽,并研究其對真菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 培養(yǎng)基和菌種

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

白色念珠菌(ATCC10231)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(ATCC25922)，上海魯微科技有限公司。

1.2 堿性氨基酸-PAF26衍生多肽的設(shè)計(jì)

以PAF26多肽為基礎(chǔ)，在多肽分子序列Ac-RKKWFW-NH2中引入2或4個堿性氨基酸：賴氨酸(K)或精氨酸(R)；為保持親疏水氨基酸比例不變，引入相應(yīng)數(shù)量的苯丙氨酸(F)。作者設(shè)計(jì)了賴氨酸-PAF26衍生多肽(K2-F2、K4-F4)和精氨酸-PAF26衍生多肽(R2-F2、R4-F4)，其分子序列和分子量見表1，委托吉爾生化(上海)有限公司合成。

表1 PAF26衍生多肽序列和分子量

1.3 堿性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能測試

為研究堿性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能，分別選擇白色念珠菌(真菌)、金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)、大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)進(jìn)行抗菌性能測試。

1.3.1 菌液的準(zhǔn)備

白色念珠菌：取少量白色念珠菌第二代斜面菌株，接種至50 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，26 ℃振蕩培養(yǎng)。

金黃色葡萄球菌：取少量金黃色葡萄球菌第二代斜面菌株，接種至50 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。

大腸桿菌：取少量大腸桿菌第二代斜面菌株，接種至50 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。

將菌株培養(yǎng)過夜后，分別取0.2 mL菌液加入到25 mL新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行再培養(yǎng)。用紫外可見分光光度計(jì)(UV1800PC，上海)測試600 nm處的吸光度值(OD)，待吸光度值達(dá)到0.1后，進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 衍生多肽的抗菌性能測試

多肽溶液的配制：分別稱取10 mg 衍生多肽，配制成濃度(mg·mL-1)為1.000、0.500、0.250、0.125、0.062、0.031、0.015的多肽溶液。

抗菌實(shí)驗(yàn)：將不同濃度多肽溶液分別加入到96孔板中，每孔100 μL；并選擇超純水作為陰性對照組，每個濃度設(shè)置6個平行樣。紫外光照射1 h進(jìn)行滅菌處理后，每孔分別加入100 μL吸光度值為0.1的白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的菌液；孵育10 min后，用酶標(biāo)儀(DNM-9602，北京)測試初始吸光度值，記錄為0 h吸光度值；將多肽溶液與菌液共培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀測試吸光度值，記錄為24 h吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 賴氨酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能分析

2.1.1 白色念珠菌

K2-F2、K4-F4多肽與白色念珠菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖1。

由圖1可知，在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，當(dāng)K2-F2多肽濃度≥0.250 mg·mL-1、K4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽溶解性較差。與白色念珠菌共培養(yǎng)24 h后，當(dāng)K2-F2多肽濃度≥0.125 mg·mL-1、K4-F4多肽濃度≥0.250 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制白色念珠菌生長的效果，且K2-F2多肽的抗菌效果優(yōu)于K4-F4多肽的。

2.1.2 金黃色葡萄球菌

K2-F2、K4-F4多肽與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖2。

由圖2可知，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，當(dāng)K2-F2、K4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽溶解性較差。與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)24 h后，當(dāng)K2-F2多肽濃度≥0.062 mg·mL-1、K4-F4多肽濃度≥0.125 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制金黃色葡萄球菌生長的效果，且K2-F2多肽的抗菌效果優(yōu)于K4-F4多肽的。

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

2.1.3 大腸桿菌

K2-F2、K4-F4多肽與大腸桿菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖3。

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

由圖3可知，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，當(dāng)K2-F2、K4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽的溶解性較差。與大腸桿菌共培養(yǎng)24 h 后，當(dāng)K2-F2、K4-F4多肽濃度≥0.250 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制大腸桿菌生長的效果，且K2-F2的抗菌效果優(yōu)于K4-F4多肽的。

2.2 精氨酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能分析

2.2.1 白色念珠菌

R2-F2、R4-F4多肽與白色念珠菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖4。

由圖4可知，在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，當(dāng)R2-F2、R4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽溶解性較差。與白色念珠菌共培養(yǎng)24 h后，當(dāng)R2-F2多肽濃度≥0.125 mg·mL-1、R4-F4多肽濃度≥0.250 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制白色念珠菌生長的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果優(yōu)于R4-F4多肽的。和圖1相比較，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果優(yōu)于K2-F2、K4-F4多肽的。

2.2.2 金黃色葡萄球菌

R2-F2、R4-F4多肽與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖5。

a.R2-F2多肽 b.R4-F4多肽

由圖5可知，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，當(dāng)R2-F2、R4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽溶解性較差。與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)24 h后，當(dāng)R2-F2多肽濃度≥0.031 mg·mL-1、R4-F4多肽濃度≥0.062 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制金黃色葡萄球菌生長的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果優(yōu)于R4-F4多肽的。和圖2相比較，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果優(yōu)于K2-F2、K4-F4多肽的。

2.2.3 大腸桿菌

R2-F2、R4-F4多肽與大腸桿菌共培養(yǎng)0 h和24 h的吸光度值見圖6。

由圖6可知，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，當(dāng)R2-F2、R4-F4多肽濃度≥0.500 mg·mL-1時(shí)，吸光度值顯著增大，說明該濃度多肽溶解性較差。與大腸桿菌共培養(yǎng)24 h后，當(dāng)R2-F2多肽濃度≥0.125 mg·mL-1、R4-F4多肽濃度≥0.250 mg·mL-1時(shí)，菌液的吸光度值相比0 h沒有大幅增大，說明該濃度多肽有顯著抑制大腸桿菌生長的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果優(yōu)于R4-F4多肽的。和圖3相比較，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果優(yōu)于K2-F2、K4-F4多肽的。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)了4種具有不同分子序列的堿性氨基酸-PAF26衍生多肽，并研究其對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗菌性能。結(jié)果表明，相比于賴氨酸-PAF26衍生多肽，精氨酸-PAF26衍生多肽具有更加優(yōu)異的抗菌效果；相比于引入4個堿性氨基酸，引入2個堿性氨基酸的PAF26衍生多肽具有更加優(yōu)異的抗菌效果；相比于大腸桿菌，堿性氨基酸-PAF26衍生多肽對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌具有更加優(yōu)異的抗菌效果。為新型抗菌肽的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了參考。

a.R2-F2多肽 b.R4-F4多肽