徐順林，格桑志瑪，土登·降擁尼瑪，賈禮華

膽囊癌是目前臨床較為罕見(jiàn)的一種高致死性惡性腫瘤性疾病[1]。2018年，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析顯示，膽囊癌占所有癌癥相關(guān)死亡的1.7%[2]。根據(jù)報(bào)道，在世界范圍內(nèi)，膽囊癌對(duì)女性的影響較男性大，此外膽囊癌的發(fā)生率隨著人們年齡的增長(zhǎng)而逐漸升高，有2/3的膽囊癌患者年齡超過(guò)了65歲[3]。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)稱(chēng)，僅有約1/5的膽囊癌患者在腫瘤未轉(zhuǎn)移前被發(fā)現(xiàn)，這極大限制了治療方法的選擇，并且顯著縮短了患者的生存時(shí)間[4]?；瘜W(xué)療法和放射療法對(duì)膽囊癌的作用不大，根治性手術(shù)仍然是目前本病最為有效的治療方法。但是因?yàn)槟懩野┗颊叱跗诔３o(wú)癥狀及其快速轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，使得大多數(shù)膽囊癌患者診斷時(shí)已處于晚期，只有不到20%的患者符合手術(shù)切除條件，導(dǎo)致該病預(yù)后大多不良[5]。因此，發(fā)現(xiàn)新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物用于預(yù)后評(píng)估和深入闡明癌癥進(jìn)展的分子機(jī)制，對(duì)于更好地治療膽囊癌具有一定的價(jià)值。MicroRNA(miRNA)是非編碼、進(jìn)化保守的單鏈RNA，它們附著在其靶基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)上，并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控發(fā)揮著各種生物學(xué)功能[6]。最近許多miRNA已證明可作為癌癥有效的生物學(xué)標(biāo)志物或功能性調(diào)節(jié)劑[7]。故本研究擬通過(guò)對(duì)膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143水平進(jìn)行分析，探討其與膽囊癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月—2017年6月就診的膽囊癌患者86例作為疾病組，同期體檢健康志愿者40例作為對(duì)照組。疾病組中男33例，女53例；年齡52～75(64.28±5.47)歲；分化程度：低分化39例，中分化25例，高分化22例；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期36例，Ⅳ期17例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。對(duì)照組中男14例，女26例；年齡50～75(62.15±4.85)歲。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)第八版《外科學(xué)》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)初診為膽囊癌；經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診；簽署本研究知情同意書(shū)；采用膽囊切除加區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù)，且未接受術(shù)后輔助治療；具有完整的臨床資料；能積極配合隨訪(fǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：已接受化療者；伴其他腫瘤者；伴心、肺、肝、腎功能不全者；失訪(fǎng)者。

1.3檢測(cè)方法 治療前，抽取2組日晨空腹靜脈血5 ml，3000 r/min離心10 min后收集血清，使用總RNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN，miRNeasy Serum Kit)提取血清總RNA，使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HaiGene，TaqMan miRNA Cdna Kit)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用2-ΔΔCt法以U6作為內(nèi)參基因檢測(cè)miRNA-187和miRNA-143表達(dá)量。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)引物序列

1.4隨訪(fǎng)方法 采用門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間截止至2020年6月或患者死亡。每2個(gè)月隨訪(fǎng)1次，記錄2組生存時(shí)間，并計(jì)算3年生存率。生存時(shí)間為確診日期到死亡日或2020年6月。

2 結(jié)果

2.12組血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)比較 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果表明，相較對(duì)照組，疾病組miRNA-187表達(dá)高，miRNA-143表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 膽囊癌患者和體檢健康志愿者血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)比較

2.2膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，與分化程度、TNM分級(jí)有關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3血清miRNA-187和miRNA-143評(píng)估膽囊癌的受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)分析 ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miRNA-187診斷膽囊癌的截?cái)嘀禐?.294，曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.775；miRNA-143診斷膽囊癌截?cái)嘀禐?.375，AUC為0.789。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miRNA-187和miRNA-143評(píng)估膽囊癌的受試者工作特征曲線(xiàn)

2.4膽囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表達(dá)與3年生存率分析 根據(jù)ROC曲線(xiàn)分析的miRNA-187和miRNA-143截?cái)嘀祵⒓膊〗M分為miRNA-187高表達(dá)亞組47例、低表達(dá)亞組39例和miRNA-143高表達(dá)亞組38例、低表達(dá)亞組48例。Kaplan-Meire生存曲線(xiàn)分析顯示：miRNA-187高表達(dá)亞組3年生存率為19.15%低于低表達(dá)亞組的51.28%，miRNA-143高表達(dá)亞組3年生存率為55.26%高于低表達(dá)亞組的16.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同血清miRNA-187表達(dá)膽囊癌患者生存曲線(xiàn)

圖3 不同血清miRNA-143表達(dá)膽囊癌患者生存曲線(xiàn)

2.5影響膽囊癌患者3年生存率的單因素分析 單因素分析結(jié)果表明，膽囊癌患者性別、年齡、分化程度與3年生存率無(wú)關(guān)(P>0.05)，TNM分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與3年生存率有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 影響膽囊癌患者3年生存率的單因素分析[例(%)]

2.6影響膽囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回歸分析 以膽囊癌患者3年生存率為因變量(死亡=1、存活=0)，以上述具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素為自變量進(jìn)行賦值(TNM分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)=1、Ⅰ～Ⅱ級(jí)=0，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移=1、無(wú)=0，miRNA-187高表達(dá)=1、低表達(dá)=0，miRNA-143低表達(dá)=1、高表達(dá)=0)。Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，TNM分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-187高表達(dá)、miRNA-143低表達(dá)是膽囊癌患者3年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 影響膽囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回歸分析

3 討論

目前尚不清楚膽囊癌的具體致病機(jī)制，但有研究已發(fā)現(xiàn)女性、地理位置、種族、先天性發(fā)育異常、肥胖、膽結(jié)石個(gè)人或家族史、膽囊慢性感染及遺傳變異與膽囊癌發(fā)生率升高相關(guān)[9]。因膽囊癌患者預(yù)后較差，分析膽囊癌發(fā)病影響因素，找出早期預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)本病早期干預(yù)、改善預(yù)后有重要意義。

既往研究表明，miRNA-187在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用，然而作用結(jié)果卻不大一致。miRNA-187在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，miRNA-187過(guò)表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。洪善超等[11]也報(bào)道前列腺癌患者血清miRNA-187水平升高，并在抑制表達(dá)后能降低前列腺癌細(xì)胞系增殖能力。另有研究表明，miRNA-187在人宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其通過(guò)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明miRNA-187能抑制小鼠宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。Wang等[13]證明miRNA-187在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，通過(guò)Kaplan-Meire生存曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)miRNA-187表達(dá)降低與結(jié)腸癌患者總生存期較短密切相關(guān)，提示miRNA-187可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些研究表明miRNA-187的表達(dá)具有異質(zhì)性。在本研究中，膽囊癌患者血清miRNA-187表達(dá)上調(diào)，與李剛強(qiáng)和濮亞斌[14]研究結(jié)果一致；同時(shí)，膽囊癌患者血清miRNA-187表達(dá)與其分化程度、TNM分級(jí)有關(guān)，且miRNA-187高表達(dá)患者3年生存率更低，表明miRNA-187可能起到促癌作用。

miRNA-143被認(rèn)為是膀胱癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等多種癌癥的抑癌因子[15]。Liu等[16]研究表明，膀胱癌患者血清中miRNA-143表達(dá)水平明顯低于健康人群，且miRNA-143表達(dá)水平與患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期存在相關(guān)性，miRNA-143低表達(dá)患者平均生存時(shí)間短于miRNA-143高表達(dá)患者。鄭新聞等[17]研究表明，miRNA-143是胰腺癌患者發(fā)病的保護(hù)因素，對(duì)評(píng)估患者病情及預(yù)后有一定價(jià)值。胡琛琛和張莉[18]報(bào)道指出，miRNA-143能下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞增殖。在本研究中，膽囊癌患者血清miRNA-143表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與患者分化程度、TNM分級(jí)有關(guān)，與He等[19]研究結(jié)果一致。He等[19]在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，miRNA-143能通過(guò)下調(diào)HIF-1α顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，這可能是本研究miRNA-143高表達(dá)患者3年生存率較高的原因。

膽囊癌患者大多預(yù)后不良，影響因素繁多。本研究Logistic多因素回歸分析結(jié)果表明，TNM分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-187高表達(dá)、miRNA-143低表達(dá)是膽囊癌患者3年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。TNM分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)膽囊癌預(yù)后影響報(bào)道較多，在此不再贅述。胡菊梅和胡旻[20]報(bào)道m(xù)iRNA-187高表達(dá)是卵巢癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并指出miRNA-187高表達(dá)可能增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，是膽囊癌的促癌因子，與本研究結(jié)果相似。miRNA-143能下調(diào)膽囊癌進(jìn)展相關(guān)蛋白表達(dá)，在膽囊癌中起抑癌作用。因而，臨床上聯(lián)合檢測(cè)miRNA-187與miRNA-143表達(dá)對(duì)評(píng)估膽囊癌患者預(yù)后具有重要意義。

綜上所述，膽囊癌患者血清miRNA-187、miRNA-143表達(dá)與其分化程度、TNM分級(jí)有一定相關(guān)性，miRNA-187低表達(dá)、miRNA-143高表達(dá)患者3年生存率高，TNM分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-187高表達(dá)、miRNA-143低表達(dá)是膽囊癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。