張翠紅，呂 欣，范 才，侯春立，馬博敬，張建軍

放射治療是食管癌一種重要、有效的治療手段，約80%的患者需接受放射治療[1-2]。然而腫瘤細(xì)胞對放射線抗拒是抗腫瘤治療失敗的主要原因之一[3]，所以如何提高腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性，在提高腫瘤局部控制率的同時降低放射線對正常組織的毒性作用是食管癌放射治療的重要研究課題。5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-CdR)屬于核苷類似物甲基化抑制劑，不僅可以抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，降低細(xì)胞分裂時DNA甲基化水平，還可以干擾RNA代謝、DNA和蛋白質(zhì)合成[4-6]。研究表明，5-aza-CdR可通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1共價結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而抑制該酶甲基轉(zhuǎn)移活性，逆轉(zhuǎn)CpG島異常甲基化、恢復(fù)腫瘤抑制因子表達(dá)，起到抑制腫瘤作用[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可能與腫瘤的放射敏感性有密切關(guān)系[8]。但目前有關(guān)5-aza-CdR在食管癌放射敏感性方面的研究甚少。故本研究以5-aza-CdR作用于人食管癌細(xì)胞株EC9706，研究其對食管癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料和主要試劑

1.1.1食管癌細(xì)胞株：人食管癌EC9706細(xì)胞購自中國細(xì)胞資源庫，用含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第二、三代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2藥物及主要試劑、儀器：5-aza-CdR購自上海研謹(jǐn)生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK8試劑購自武漢默沙克生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；一抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-ATM/ATM、β-actin及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑、蛋白濃度檢測試劑考馬斯亮藍(lán)、Western blot配膠試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯膜、ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司。Transwell小室購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞分組及照射方法：將實驗細(xì)胞分為4組：①對照組(Control組)：不做任何處理；②5-aza-CdR處理組：予不同濃度(0、0.50、1.00、1.50及3.00 μmol/L)5-aza-CdR處理細(xì)胞；③單純照射組(RT組)：僅予射線照射；④照射+5-aza-CdR處理組(RT+5-aza-CdR組)：予5-aza-CdR處理細(xì)胞48 h后行射線照射。5-aza-CdR用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解，對照組用等量PBS液處理。培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，室溫下采用6 MV-X射線照射。

1.2.2CCK-8法測定5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞毒性及照射后增殖抑制的影響：取對數(shù)生長期EC9706細(xì)胞，胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2.0×103/孔)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度5-aza-CdR，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μl新鮮無血清培養(yǎng)基，然后各孔加入CCK-8溶液10 μl，放入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[1-(吸光度實驗/吸光度對照)]×100%。實驗重復(fù)3次。采用相同方法檢測5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞放射敏感性，將接種細(xì)胞分為Control組、RT組(射線照射劑量2、4、6、8及10 Gy)和RT+5-aza-CdR組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，RT+5-aza-CdR組細(xì)胞加入1.00 μmol/L 5-aza-CdR；2 h后，RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞分別接受不同劑量射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照CCK-8法檢測吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率和放射增敏比(SER)。SER=RT組D0/RT+5-aza-CdR組D0，D0為細(xì)胞增殖活性下降50%時的放射劑量，即半數(shù)致死劑量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)：收集RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞，加入PMSF細(xì)胞裂解液，提取蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度，加熱使蛋白變性，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，血清密閉，分別加入cleaved caspase-3(1︰1000稀釋)、Bax抗體(1︰1000稀釋)、Bcl-2抗體(1︰500稀釋)、ATM/p-ATM抗體(1︰1000稀釋)、β-actin抗體(1︰20 000稀釋)，置于4℃搖床過夜。次日TBST反復(fù)沖洗，加入二抗(1︰5000稀釋)。ECL試劑顯影，拍照。實驗重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：細(xì)胞以每皿3×105個的密度接種于25 cm2培養(yǎng)皿中，貼壁后分為RT組和RT+5-aza-CdR組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞周期檢測按試劑盒說明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5Transwell小室侵襲實驗檢測5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞照射后的侵襲能力：用DMEM培養(yǎng)液將Matrigel按1︰6稀釋，取80 μl稀釋液加入到Transwell小室上室，37℃培養(yǎng)箱中過夜。收集RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞，胰蛋白酶消化制備成1×105/ml細(xì)胞懸液，接種于已鋪基質(zhì)膠的Transwell小室上室,鋪勻，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600 μl，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel膠，PBS液沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS液沖洗晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.15-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞的毒性作用 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度(0、0.50、1.00、1.50及3.00 μmol/L)5-aza-CdR處理后，細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制，分別為(0.68±0.07)%、(0.80±0.10)%、(1.13±0.32)%、(13.33±4.16)%及(38.33±7.64)%。0、0.50及1.00 μmol/L 5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞增殖抑制作用基本一致，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；1.00、1.50及3.00 μmol/L 5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞增殖抑制率經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且進(jìn)一步兩兩比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1?？梢?.00 μmol/L是5-aza-CdR無毒的最高劑量，故為排除5-aza-CdR本身對細(xì)胞增殖抑制的影響，本研究選擇1.00 μmol/L為實驗濃度行放射敏感性研究。

圖1 不同濃度5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞的毒性作用

2.25-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后增殖活性的影響 CCK-8法檢測顯示，不同放射劑量(2、4、6、8及10 Gy)照射后，細(xì)胞增殖活性受抑制，D0為6.897 Gy。而不同照射組細(xì)胞予5-aza-CdR預(yù)處理后，各組細(xì)胞增殖抑制率經(jīng)析因設(shè)計的雙因素方差分析，處理因素5-aza-CdR的主效應(yīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，處理因素放射線的主效應(yīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，二者交互作用比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。故無論是否予5-aza-CdR預(yù)處理，經(jīng)不同放射劑量照射后，細(xì)胞增殖活性均受抑制；而予5-aza-CdR預(yù)處理后，能增強放射線對EC9706細(xì)胞增殖活性的抑制作用。RT組D0為6.016 Gy，RT+5-aza-CdR組D0為4.506 Gy，SER為1.335±0.04。見表1，圖2。

表1 2組人食管癌EC9706細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后細(xì)胞增殖抑制率的變化

圖2 2組人食管癌EC9706細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后細(xì)胞增殖抑制率的變化

2.35-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后凋亡的影響 RT+5-aza-CdR組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和Bax相對表達(dá)量較RT組明顯升高(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量較RT組降低(P<0.01)。見表2，圖3。

圖3 5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表2 2組人食管癌EC9706細(xì)胞cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量變化

2.45-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，RT組(4 Gy)和RT+5-aza-CdR組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖4。與RT組比較，RT+5-aza-CdR組G0/G1期和S期細(xì)胞減少(P<0.05或P<0.01)，而G2/M期細(xì)胞增多(P<0.01)。見表3。

表3 5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響

圖4 5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響

2.55-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后DNA損傷修復(fù)的影響 EC9706細(xì)胞在照射后1 h p-ATM蛋白表達(dá)明顯增加，隨著時間推移，表達(dá)逐漸下降；RT+5-aza-CdR組照射1、24、48 h與RT組EC9706細(xì)胞中p-ATM蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明5-aza-CdR不是通過抑制DNA損傷修復(fù)來增加細(xì)胞放射敏感性的。見圖5。

圖5 5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后DNA損傷修復(fù)的影響

2.65-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞照射后侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，RT+5-aza-CdR組細(xì)胞的侵襲能力發(fā)生了改變，與RT組相比，RT+5-aza-CdR組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示5-aza-CdR可明顯增加放射線抑制食管癌細(xì)胞侵襲的能力，提高放射敏感性。見圖6。

圖6 5-aza-CdR對人食管癌EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

放射治療是食管癌常用、有效的治療手段，治療原理為利用電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA損傷甚至雙鏈斷裂，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9-11]。多年臨床實踐證實，不同患者對放射線的敏感性和耐受性差異較大，是導(dǎo)致局部治療失敗和影響患者預(yù)后的主要原因[12]。因此，如何改善食管癌細(xì)胞的放射敏感性，是提高食管癌患者放射治療效果、減少局部復(fù)發(fā)及實現(xiàn)個體化治療的有效策略[13]。

5-aza-CdR作為胞嘧啶類似物，不僅表現(xiàn)出顯著的去甲基化作用，而且具有直接的抗腫瘤作用[14-17]，雖然其臨床應(yīng)用較為廣泛，但是在食管癌放射敏感性方面的研究卻較少見。蔡銳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可增加鼻咽癌細(xì)胞株C666-1的放射敏感性。Hu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對孕酮治療的敏感性。除此之外，F(xiàn)üller等[20]發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR通過改變DNA甲基化，在急性白血病和非小細(xì)胞肺癌治療過程中，可以與多種化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)而提高療效。以上研究提示我們，5-aza-CdR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)行為、功能改變及放化療敏感性方面發(fā)揮重要作用。因此，探究5-aza-CdR在食管癌治療中的作用，有可能為尋求更佳治療手段提供新的思路和方法。

在本研究中，我們首先通過CCK-8法確定5-aza-CdR最高無毒劑量為1.00 μmol/L。因此，在后續(xù)實驗中初步選定1.00 μmol/L作為5-aza-CdR的用藥劑量。進(jìn)一步在放射線照射前2 h予1.00 μmol/L 5-aza-CdR預(yù)處理，后采用CCK-8法檢測證實1.00 μmol/L 5-aza-CdR可增強不同照射劑量對EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用，SER為1.335±0.04。

藥物增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性的機制一般與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[21]。Bcl-2蛋白家族和cleaved caspase-3都屬于重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。Bcl-2屬于抗凋亡因子，可以抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，而Bax為促凋亡蛋白，可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而啟動細(xì)胞凋亡[22]。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增強時，其與Bax形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[23-25]。所以我們進(jìn)一步從凋亡蛋白分子水平分析5-aza-CdR對EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響。結(jié)果顯示：5-aza-CdR聯(lián)合射線照射處理EC9706細(xì)胞后，cleaved caspase-3和Bax表達(dá)較單純照射處理明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細(xì)胞株SaOS2、HOS和U2OS中，5-aza-CdR通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增加細(xì)胞凋亡來增加放射敏感性，提示5-aza-CdR可能是提高骨肉瘤治療效果的潛在放射增敏劑[26]。Qiu等[27]利用5株胃癌細(xì)胞株(OCUM-2M、OCUM-12、KATO-Ⅲ、MKN-45和MKN-74)觀察5-aza-CdR聯(lián)合照射對胃癌細(xì)胞生長活性、細(xì)胞周期分布及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5-aza-CdR聯(lián)合照射明顯降低了OCUM-2M、OCUM-12和MKN-45細(xì)胞的生長活性，而G2/M期細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率均升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在5-aza-CdR聯(lián)合射線照射干預(yù)下，G0/G1期和S期細(xì)胞減少，而G2/M期細(xì)胞增多。p-ATM與DNA損傷相關(guān),當(dāng)DNA損傷時，ATM激酶被激活,使其下游的反應(yīng)元件發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞周期關(guān)卡處停滯分裂,使損傷的DNA獲得修復(fù)的時間,若修復(fù)失敗則細(xì)胞進(jìn)入凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，p-ATM蛋白表達(dá)隨著時間的推移無明顯差異。最后，我們探究了5-aza-CdR聯(lián)合射線照射對EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR聯(lián)合射線照射使EC9706細(xì)胞的穿膜數(shù)量明顯減少，侵襲能力下降。以上結(jié)果說明5-aza-CdR不是通過抑制DNA損傷修復(fù)來提高放射敏感性的，而是通過升高射線照射后細(xì)胞凋亡率、影響細(xì)胞周期和增強放射線抑制細(xì)胞侵襲的能力，從而提高食管癌細(xì)胞放射敏感性。然而5-aza-CdR是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞甲基化狀態(tài)還是通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還需進(jìn)行深入研究。

綜上所述，1.00 μmol/L 5-aza-CdR可增加人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性，其作用機制可能與5-aza-CdR能增加放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期及增強放射線抑制細(xì)胞侵襲的能力有關(guān)，為5-aza-CdR用于放射治療增敏提供一定的實驗依據(jù)，但是其是否可以作為放射治療增敏劑用于臨床，尚需要更全面、更系統(tǒng)的實驗研究。