楊 龍，彭 偉，張洪濤，查 元，師 婷，李 琳

原發(fā)性肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，早期無(wú)明顯癥狀體征，隨著病情發(fā)展可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、消化道癥狀及肝大等，惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，嚴(yán)重危及患者生命安全[1-3]。本病主要病因是病毒性肝炎及肝硬化，據(jù)統(tǒng)計(jì)在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中原發(fā)性肝癌發(fā)生率為10%～20%[4]。目前臨床常采用甲胎蛋白和超聲篩查早期肝癌，但前者靈敏度較低，后者對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)水平要求較高[5]。病理檢查雖是診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但成本較高，可重復(fù)性較差，且具有一定創(chuàng)傷性[6]。因此尋找敏感性較高的預(yù)測(cè)指標(biāo)至關(guān)重要。近年來(lái)，炎癥體及下游炎性因子在肝硬化及肝癌中的作用備受關(guān)注，炎癥體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD樣受體及其形成的多蛋白水解復(fù)合物，在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[7]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是宿主先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與抵抗病原體。白細(xì)胞介素是由單核、巨噬及淋巴細(xì)胞分泌的炎性因子，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[8]。白細(xì)胞介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是NLRP3炎性小體分泌的炎性因子，其中IL-18可促進(jìn)肥大細(xì)胞、T細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞分泌Th2，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；IL-1β可促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞聚集，并維持相關(guān)細(xì)胞因子水平[9]。但目前肝硬化及肝癌發(fā)病過(guò)程中的細(xì)胞分子激活機(jī)制和炎癥激活后啟動(dòng)組織細(xì)胞的損傷機(jī)制仍不清楚。為深入了解血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平與肝硬化、肝癌的關(guān)系，本研究檢測(cè)肝硬化、肝癌患者血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平，以期為臨床診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月—2020年2月我院肝膽外科收治的70例肝硬化患者(肝硬化組)和60例肝癌患者(肝癌組)，另選取同期于我院體檢的50例健康者作為健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查或符合“原發(fā)性肝癌診療規(guī)范”[10]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝癌者；經(jīng)病理檢查或符合《慢性乙型肝炎防治指南》[11]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝硬化者；年齡30～75歲者；未經(jīng)手術(shù)及藥物治療者；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心、肺功能不全者；合并其他惡性腫瘤者；合并認(rèn)知障礙者；臨床資料不完整者。肝硬化組中男40例，女30例；年齡31～74(50.06±6.28)歲；病程(4.78±0.60)年。肝癌組中男36例，女24例；年齡30～72(51.27±6.30)歲；病程(4.32±0.56)年。健康組中男31例，女19例；年齡30～75(50.06±6.28)歲。3組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法 采集3組患者空腹靜脈血4 ml，保存于EDTA抗凝管中待測(cè)。

1.2.1血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平測(cè)定：3000 r/min離心4 min，分離上清液后采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平。

1.2.2NLRP3 mRNA表達(dá)量測(cè)定：肝素抗凝，離心分離出血清后采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)。加入淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入1 ml Trizol混勻后按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，加30 μl無(wú)RNA酶水溶解沉淀，得到RNA溶液。建立20 μl的反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，終止反應(yīng)。產(chǎn)物cDNA置于-20℃環(huán)境保存?zhèn)溆?。建?5 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，得到擴(kuò)增曲線(xiàn)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s后得到溶解曲線(xiàn)。每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔，Ct差值<0.5。

1.2.3肝功能指標(biāo)測(cè)定：采用羅氏全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)水平。

1.2.4相關(guān)性分析：采用Spearman相關(guān)分析探討肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.13組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平比較 肝癌組和肝硬化組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平高于健康組，肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組和健康組血清IL-18水平低于肝硬化組，健康組血清IL-18水平高于肝癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平比較

2.23組肝功能指標(biāo)比較 肝癌組和肝硬化組ALT、TBIL、AST及GGT水平均顯著高于健康組，肝癌組ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組肝功能指標(biāo)比較

2.3肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量與ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)；血清IL-18水平與TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與ALT水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清IL-1β水平與TBIL、AST水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與ALT、GGT水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖1。

圖1 肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性散點(diǎn)圖

表3 肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，15%的腫瘤是由慢性感染性炎癥誘發(fā)，如慢性支氣管炎可增加患肺癌風(fēng)險(xiǎn)；肝炎和肝硬化可增加患肝癌風(fēng)險(xiǎn)[12]。HBV感染可致慢性肝臟炎癥，并誘發(fā)肝癌。報(bào)道顯示肝癌患者5年生存率約為50%[13]。故抑制慢性病毒性肝炎及肝硬化患者疾病進(jìn)展對(duì)改善患者預(yù)后非常重要。

NLRP3炎性小體是大分子多蛋白復(fù)合體，NLRP3激活后可發(fā)生自身寡聚化，并在銜接蛋白ASC作用下形成NLRP3炎性復(fù)合體[14]，進(jìn)而使pro-caspase-1剪切為有活性的caspe-1并切割其底物，以促進(jìn)IL-1β、IL-18成熟，進(jìn)而誘發(fā)炎性因子釋放[15-17]。同時(shí)炎性細(xì)胞可吞噬和凋亡肝臟上皮細(xì)胞，并損傷和破壞肝臟上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體完整性，進(jìn)而加速肝功能惡化[18]。IL-18是由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其活性，促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生和分泌，同時(shí)也可致免疫損傷，使淋巴細(xì)胞數(shù)量上升，增強(qiáng)免疫防御效應(yīng)[19]。IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)功能的炎性因子，可促進(jìn)T、B細(xì)胞活化、增殖及分化，同時(shí)可促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子合成，并誘導(dǎo)血管新生，上調(diào)COX-2表達(dá)，促使肝癌發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組和肝硬化組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平高于健康組，與董德嘉等[21]報(bào)道一致，說(shuō)明肝硬化和肝癌患者體內(nèi)存在NLRP3、IL-1β分泌調(diào)節(jié)紊亂，分析原因可能為NLRP3、IL-1β均可激活T、B細(xì)胞激發(fā)自然殺傷和單核細(xì)胞活性，與抗原結(jié)合及病毒感染后可改變肝細(xì)胞膜成分，致肝細(xì)胞壞死及功能異常。而肝癌組血清IL-18水平低于健康組，提示肝癌患者IL-18水平下降可能與免疫功能下降有關(guān)，故提高血清IL-18水平可增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫能力。且肝硬化組血清IL-18水平高于健康組，可能是因肝硬化患者肝細(xì)胞解毒功能和排泄能力下降導(dǎo)致IL-18無(wú)法正常代謝所致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平高于肝硬化組，提示NLRP3、IL-1β隨病情嚴(yán)重程度加重而升高，原因可能為NLRP3激活后可促進(jìn)IL-1β分泌，進(jìn)而損傷和破壞肝臟上皮細(xì)胞，加速肝功能惡化。不同的是，肝癌組IL-18低于肝硬化組，原因可能與炎癥反應(yīng)和免疫功能相關(guān)，因肝癌患者自身免疫防御效應(yīng)低下，致IL-18水平低表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明NLRP3、IL-18、IL-1β水平與疾病進(jìn)展具有相關(guān)性。

NLRP3為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3，IL-18為白細(xì)胞介素-18，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，TBIL為總膽紅素，AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GGT為谷氨酰轉(zhuǎn)移酶大多數(shù)肝病、肝損傷患者肝功能指標(biāo)升高，本研究結(jié)果顯示，肝癌組和肝硬化組ALT、TBIL、AST及GGT水平均顯著高于健康組，與謝梅和王芳[22]報(bào)道一致，說(shuō)明肝炎病毒感染可導(dǎo)致肝功能異常，分析原因可能與宿主免疫損傷作用有關(guān)。有研究表明，AST、ALT、白蛋白與肝臟損傷程度有關(guān)[23]。本研究結(jié)果還顯示，肝癌組ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化組，提示ALT、TBIL、AST及GGT越高肝臟損害越嚴(yán)重。

與其他研究不同的是，本研究分析NLRP3、IL-18、IL-1β與肝功能的相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析顯示，肝癌組NLRP3 mRNA表達(dá)量與ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)；血清IL-18水平與TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)，與ALT水平呈負(fù)相關(guān)；血清IL-1β水平與TBIL、AST水平呈正相關(guān)，與ALT、GGT水平呈負(fù)相關(guān)。提示血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝功能具有一定的相關(guān)性，可作為評(píng)估肝癌預(yù)后的有效指標(biāo)。但本研究納入對(duì)象數(shù)量較少，且為回顧性研究，結(jié)果可能存在一定偏倚，今后將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行前瞻性研究，進(jìn)一步分析血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝癌的相關(guān)性。

綜上所述，血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝硬化進(jìn)展存在相關(guān)性，NLRP3、IL-1β隨疾病嚴(yán)重程度而升高，病程進(jìn)展至肝癌時(shí)IL-18表達(dá)降低。