姜蘇月 靳俊媛 劉靜 劉寶玉 孫福慶 白慶榮

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)(巴彥淖爾市植保植檢站) (雙遼市園藝特產(chǎn)站) (吉林農(nóng)業(yè)大學)

羽扇豆(Lupinusmicranthus)俗稱魯冰花，是薔薇目豆亞目豆科蝶形花亞科羽扇豆屬一年生或多年生草本植物，有觀賞和食用2種用途。羽扇豆自然分布非常廣泛，品種繁多，主要分布在東半球的非洲和地中海地區(qū)以及西半球的美洲。觀賞羽扇豆基生掌狀復(fù)葉，葉形有橢圓、卵圓、窄葉等，頂生總狀花序，花期達2個多月?；ㄉ袉紊蛷?fù)色，具有較高的觀賞價值，可用于室內(nèi)和室外的綠化[1]。炭疽病是常見的真菌病害，且寄主范圍極為廣泛，目前國內(nèi)外報道的炭疽病原菌侵染的寄主主要有玉米(Zeamays)、芒果(Mangiferaindica)、茶樹(Camelliasinensis)、辣椒(Capsicumannuum)、葫蘆科(Cucurbitaceae)作物等重要經(jīng)濟作物，對植物的根、莖、葉和果實均可危害[2-6]。2017年6月在長春市百花園種植的羽扇豆受到一種病害的嚴重威脅。該病害在羽扇豆的苗期發(fā)生，發(fā)病率超過40%，發(fā)病嚴重的葉邊緣出現(xiàn)大量圓形或橢圓形病斑，莖部和生長點受害嚴重的扭曲壞死，嚴重影響了羽扇豆的經(jīng)濟價值和觀賞價值。該病害在美國[7]、韓國[8]等地有所報道，但國內(nèi)報道較少，江西農(nóng)業(yè)大學的Zou et al.[9]也僅是將羽扇豆炭疽病病原菌鑒定為Colletotrichumlupini。因此,進一步研究該病原菌的生物學特性，篩選出高效的防治藥劑，對該病害的預(yù)防與防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病害標本的采集及癥狀觀察

2017年6月，在長春市百花園培育的盆栽羽扇豆幼苗上發(fā)現(xiàn)病害，對病害癥狀進行數(shù)碼拍照記錄，用剪刀從根部剪取病害植株放入采集袋中，以備后期制成病害標本保存，并在實驗室對其進行顯微鏡觀察。

1.2 病原菌分離、純化和致病性測定

采用組織分離法對病原菌進行分離，剪取罹病植株病健交界處組織2～5 mm2，在體積分數(shù)75%的乙醇中消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，置PDA平板上，每皿4塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)。挑取菌落邊緣的菌絲，移植到PDA培養(yǎng)基上進行純化，純化的菌種保存?zhèn)溆肹10]。

將純化的分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，配成105個·mL-1的孢子懸液，然后將孢子懸液噴灑到已消毒的5株健康羽扇豆幼苗上，用無菌水噴灑的植株作為對照，22～25 ℃溫室中塑料袋保濕培養(yǎng)72 h，去掉塑料袋，定期觀察并記錄植株發(fā)病情況。

1.3 病原菌形態(tài)特征及DNA序列測定

觀察培養(yǎng)基上病原菌的菌落形態(tài)、顏色及生長狀況。顯微鏡下觀察病原菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，孢子的形態(tài)，并測量孢子(100個)大小，做好記錄。

采用CTAB法[11]提取病原菌菌絲體的總DNA。以總DNA為模板，利用ITS4/ITS5(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增病原菌的ITS區(qū)段，利用特異性引物CHS-79F/CHS-345R(5′-TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG-3′)/(5′-TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3′)擴增查爾酮合成酶基因、利用GDF/GDR(5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′)/(5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′)擴增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因、利用T1/Bt-2b(5′-AACATGCGTGAGATTGATAGT-3′)/(5′-ACCCTCAGTGTSGTGACCCTTGGC-3′)擴增β-Tubulin基因。送至生工生物工程公司進行測序，并將所得的序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的相關(guān)序列進行同源性比較。

1.4 病原菌生物學特性測定

培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：將直徑為8 mm的菌餅分別放置在PDA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、CA培養(yǎng)基、黃瓜培養(yǎng)基和V8培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3次重復(fù)。采用十字交叉法5 d后測量菌落直徑，10 d血球計數(shù)板計算產(chǎn)孢量[12](測定方法下同)。

光照對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：將病原菌放置在不同光照條件下(全光照、12 h光照-12 h黑暗和完全黑暗)培養(yǎng)，3次重復(fù)。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產(chǎn)孢量。

溫度對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：將培養(yǎng)在PDA平板上的病原菌分別放置在培養(yǎng)箱中，4、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)[13]。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產(chǎn)孢量。

氮源對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，稱取等量的硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、L-丙氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、硝酸銨代替查氏培養(yǎng)基中的氮源[14]，每個處理做3次重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑，10 d計算產(chǎn)孢量。

碳源對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，稱取等量的果糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖代替查氏培養(yǎng)基的碳源，每個處理3次重復(fù)[15]。25 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑，10 d計算產(chǎn)孢量。

pH對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響：用HCl(1 mol·L-1)和NaOH(1 mol·L-1)調(diào)試滅菌后的PDA培養(yǎng)基pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，將8 mm的病原菌菌餅接在不同pH的平板上，3次重復(fù)[16]。5 d后測量菌落直徑，10 d計算產(chǎn)孢量。

病原菌菌絲及孢子的致死溫度：將培養(yǎng)好的病原菌斜面試管，分別放在水浴鍋中35、40、45、50、55、60、65、70 ℃恒溫處理10 min。完成后放置冷水中冷卻到室溫，再將試管內(nèi)的菌絲轉(zhuǎn)入PDA平板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)，觀察菌絲是否生長，確定菌絲的致死范圍，再以1 ℃為梯度確定菌絲的致死溫度。配制成孢子懸液，注入滅菌后的2 mL試管中，分別置35、40、45、50、55、60、65、70 ℃恒溫處理10 min，完成后放入冷水中冷卻，3次重復(fù)，恒溫培養(yǎng)觀察孢子是否萌發(fā)，確定孢子致死范圍，再以1 ℃為梯度確定孢子的致死溫度。

采用DPS2.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并用Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

1.5 室內(nèi)藥劑敏感性測定

供試菌株：YSD01、YSD02由吉林農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理實驗室分離鑒定并保存。

供試藥劑：質(zhì)量分數(shù)10%苯醚甲環(huán)唑WG、250 g·L-1嘧菌酯SC、質(zhì)量分數(shù)75%百菌清WP(先正達作物保護有限公司)；質(zhì)量分數(shù)60%唑醚·代森聯(lián)WG(巴斯夫有限公司)；質(zhì)量分數(shù)75%肟菌·戊唑醇WG(拜耳作物科學有限公司)；質(zhì)量分數(shù)50%多菌靈WP(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)；質(zhì)量分數(shù)70%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)；250 g·L-1咪鮮胺EC(允發(fā)化工有限公司)；質(zhì)量分數(shù)50%克菌丹WP(安道麥馬克西姆有限公司)；質(zhì)量分數(shù)70%代森聯(lián)WG、250 g·L-1吡唑醚菌酯EC(巴斯夫植物保護有限公司)；質(zhì)量分數(shù)40%腈菌唑WP(運城綠康實業(yè)有限公司)；體積分數(shù)22.5%啶氧菌酯SC(美國杜邦公司)；質(zhì)量分數(shù)25%咪鮮胺·多菌靈WP(上?；莨饣瘜W有限公司)；質(zhì)量分數(shù)65%代森鋅WP(上?；莨猸h(huán)境科技有限公司)；體積分數(shù)15%氟硅唑EW(廣東中迅農(nóng)科股份有限公司)；500 g·L-1甲基硫菌靈SC(江蘇龍燈化學有限公司)；質(zhì)量分數(shù)50%異菌脲WP(蘇州富美實植物保護劑有限公司)；質(zhì)量分數(shù)40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP(日本曹達株式會社)；430 g·L-1戊唑醇SC(江蘇豐州集團股份有限公司)。

采用生長速率法[17]，比較病原菌在不同混藥平板中生長受抑制的程度。將不同藥劑配置成1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg·L-16個質(zhì)量濃度。將配置好的藥劑溶液按照質(zhì)量濃度由低到高分別取1 mL加入滅菌后冷卻的含有9 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，充分混勻配置成混藥平板。每種藥劑3次重復(fù)。對照培養(yǎng)基加入等體積的無菌水。將病原菌打成8 mm菌餅放置在混藥平板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。待對照病原菌菌絲長至培養(yǎng)皿2/3時，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長的抑制率。

孢子萌發(fā)法：制備105個·mL-1的孢子懸液，取0.1 mL孢子懸液涂布于藥劑質(zhì)量濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mg·L-1的WA混藥平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h對孢子萌發(fā)情況進行觀察，以芽管長度超過孢子最大直徑長度的一半作為該孢子是否萌發(fā)的標準。當對照平板上孢子萌發(fā)率達到80%以上時，4 ℃冷藏終止孢子萌發(fā)，逐一觀察不同處理平板上孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù))/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100%。

查機率值與抑制率換算表，用最小二乘法建立毒力回歸方程，計算各藥劑對病原菌的有效中濃度(EC50)，比較病原菌對各種藥劑的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

病害多從羽扇豆葉片邊緣開始發(fā)生，病斑半圓形或橢圓形，病斑蒼白色或枯草色，邊緣清晰，深褐色，病健交界明顯；嫩莖受害，形成深褐色梭形病斑，生長點受害，幼嫩部分扭曲畸形直至干枯死亡(見圖1)。

圖1 羽扇豆炭疽病病害癥狀

2.2 病原菌分離、純化及致病性

經(jīng)組織分離和單孢純化，分別從葉片和莖部獲得2株分離物，命名為YSD01，YSD02。采用孢子懸液噴霧法接種健康的羽扇豆幼苗植株，接種7 d后羽扇豆開始發(fā)病，10 d后葉片出現(xiàn)明顯的病斑，莖部扭曲壞死。不同分離部位得到的菌株所引起的癥狀相同(見圖2)。從發(fā)病部位再分離后得到的分離物與接種的菌株形態(tài)相同，證實分離獲得的菌株為致病菌。因菌株YSD01與YSD02形態(tài)特征一致，為同一株菌，故后續(xù)試驗均以YSD01為樣本。

A.對照植株；B、C.發(fā)病植株；D.葉片發(fā)病癥狀；E.莖部發(fā)病癥狀。

2.3 病原菌的形態(tài)特征及分子生物學

形態(tài)特征：病原菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d，菌落近圓形，白色至淺灰色，產(chǎn)生氣生菌絲體，背面深墨綠色，菌落直徑為30～44 mm，菌落7～10 d長滿直徑90 mm平板。分生孢子產(chǎn)生于單個或分支的菌絲頂端，無色，圓柱形，一端尖，一端圓潤，有時兩端圓潤，無分隔，直或稍彎曲，大小為(10.84～22.21)μm×(3.58～6.74)μm(見圖3)。

病原菌分子生物學：利用通用引物ITS4/ITS5、特異性引物CHS-79F/CHS-345R、GDF/DFR和T1/Bt-26對代表菌株進行PCR擴增。測序結(jié)果與GenBank中相關(guān)序列進行同源性比較，ITS序列(GenBank登錄號為MH178095)與Colletotrichumlupini(Accession No.KF207599.1)序列同源性為99%，CHS序列(GenBank登錄號為MK052978)與Colletotrichumlupini(Accession No.JQ948822.1)序列同源性為100%，GADPH序列(GenBank登錄號為MK036022)與Colletotrichumlupini(Accession No.KU974983.1)序列同源性為100%，TUB序列(GenBank登錄號為MK036021)與Colletotrichumlupini(Accession No.JQ949812.1)序列同源性為100%，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株YSD01與C.lupini聚為一個進化枝，且支持率100%，查閱文獻[18]，結(jié)合形態(tài)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹確定該病原菌為Colletotrichumlupini。

A.PDA菌落正面形態(tài)；B.PDA菌落背面形態(tài)；C、D.分生孢子。

圖4 基于CHS、GAPDH、TUB三基因合并序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 培養(yǎng)條件對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

2.4.1 培養(yǎng)基的影響

菌株YSD01在8種培養(yǎng)基上均能生長和產(chǎn)孢，在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長和產(chǎn)孢最好，在V8培養(yǎng)基上菌絲生長最慢，在WA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量較低(見表1)。

表1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

2.4.2 光照的影響

菌株YSD01在不同光照條件下生長和產(chǎn)孢量不同，光照有利于菌絲生長和產(chǎn)孢，黑暗條件下菌絲生長較慢且產(chǎn)孢量低(見表2)。

表2 不同光照培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

2.4.3 溫度的影響

菌株YSD01在20～30 ℃菌絲生長良好，在25 ℃時菌絲生長最好；10～30 ℃均能產(chǎn)生孢子，25 ℃時產(chǎn)生孢子最多。在5 ℃和35 ℃時不產(chǎn)生孢子(見表3)。

表3 不同溫度培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

2.4.4 氮源的影響

菌株YSD01在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快；在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最好；在以硫酸銨和硝酸銨為氮源培養(yǎng)基中未產(chǎn)孢(見表4)。

表4 不同氮源培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

2.4.5 碳源的影響

菌株YSD01在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度最快，其次為麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基；以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最好；在以木糖為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢較低(見表5)。

2.4.6 pH的影響

菌株YSD01在pH=4～11條件下菌絲均能生長，pH=7時菌絲生長和產(chǎn)孢最佳，pH=4菌絲生長和產(chǎn)孢較差(見表6)。

表5 不同碳源培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

表6 不同pH培養(yǎng)時病原菌菌株YSD01菌絲生長及產(chǎn)孢量

2.4.7 病原菌菌絲及孢子的致死溫度

以5 ℃為梯度，確定病原菌菌絲和孢子的致死溫度均在50～55 ℃，再以1 ℃為梯度，確定病原菌菌絲致死溫度為51 ℃，孢子致死溫度為52 ℃。

2.5 病原菌對不同室內(nèi)藥劑的敏感性

由表7可見，在20種供試藥劑中，病原菌菌絲對質(zhì)量分數(shù)50%多菌靈、質(zhì)量分數(shù)75%肟菌戊唑醇和質(zhì)量分數(shù)10%苯醚甲環(huán)唑敏感性較高，其EC50<0.1 mg·L-1；250 g·L-1吡唑醚菌酯、430 g·L-1戊唑醇、質(zhì)量分數(shù)60%唑醚代森聯(lián)、250 g·L-1咪鮮胺、質(zhì)量分數(shù)25%咪鮮多菌靈、體積分數(shù)22.5%啶氧菌酯、體積分數(shù)15%氟硅唑敏感性次之，其0.1 mg·L-1≤EC50<1.0 mg·L-1；質(zhì)量分數(shù)80%克菌丹、500 g·L-1甲基硫菌靈、質(zhì)量分數(shù)40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、質(zhì)量分數(shù)75%百菌清、質(zhì)量分數(shù)65%代森鋅敏感性較差，其EC50>20.0 mg·L-1。

病原菌孢子對質(zhì)量分數(shù)80%代森錳鋅、質(zhì)量分數(shù)75%百菌清、質(zhì)量分數(shù)70%代森聯(lián)、質(zhì)量分數(shù)80%克菌丹、質(zhì)量分數(shù)60%唑醚代森聯(lián)、250 g·L-1吡唑醚菌酯敏感性較高，其EC50<1.0 mg·L-1；250 g·L-1嘧菌酯、體積分數(shù)15%氟硅唑、質(zhì)量分數(shù)65%代森鋅、質(zhì)量分數(shù)40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、體積分數(shù)22.5%啶氧菌酯、質(zhì)量分數(shù)75%肟菌戊唑醇、250 g·L-1咪鮮胺、430 g·L-1戊唑醇、質(zhì)量分數(shù)10%苯醚甲環(huán)唑敏感性次之，其0.1 mg·L-1≤EC50<10.0 mg·L-1；質(zhì)量分數(shù)40%腈菌唑、質(zhì)量分數(shù)50%異菌脲、500 g·L-1甲基硫菌靈敏感性差，其EC50≥20.0 mg·L-1(表7)。

表7 病原菌菌絲和孢子對20種藥劑的敏感性

3 結(jié)束語

本研究在長春市百花園采集到的羽扇豆病害樣本，經(jīng)分離純化、致病性測定，再分離得到的結(jié)果進一步證實獲得的分離物為致病菌，再通過形態(tài)特征和多基因序列分析，確定引起該病害的病原菌為Colletotrichumlupini。

2002年Nirenberg et al.[19]將羽扇豆炭疽病病原菌鑒定為Colletotrichumlupini。2014年美國的Rosskopf et al.[7]首次報道該病害在美國弗羅里達州發(fā)生；同年，Han et al.[8]在韓國龍仁市發(fā)現(xiàn)該病害并進行了首次報道。2019年江西農(nóng)業(yè)大學的Zou et al.[9]首次報道了國內(nèi)發(fā)生的羽扇豆炭疽病，但這些報道僅對羽扇豆炭疽病的病原菌進行了鑒定、對病害癥狀和病原菌的形態(tài)特征進行了描述，但對病原菌的生物學特性及其防治沒有進行研究。本研究從羽扇豆炭疽病分離得到的病原菌與Zou et al.[9]報道的病原菌形態(tài)特征一致。本研究還對羽扇豆炭疽病病原菌的生物學特性進行了測定，掌握了病害發(fā)生規(guī)律，并采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法進行藥劑敏感性測定，結(jié)果表明病原菌菌絲和孢子對質(zhì)量分數(shù)60%唑醚代森聯(lián)和250 g·L-1吡唑醚菌酯都具有敏感性，建議生產(chǎn)中可選擇這2種殺菌劑進行防治，有效控制病害發(fā)生。