張滿倉(cāng)，張 超,2，趙 朋，陳 越，陳 勤，盧海彬*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100；2 陜西省土地工程建設(shè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，西安 710753；3 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵 712100)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育中會(huì)受到外界環(huán)境的多種脅迫作用，為了適應(yīng)多變的環(huán)境，植物需要對(duì)環(huán)境信號(hào)做出反應(yīng)，而Ca2+作為信號(hào)傳遞的第二信使具有至關(guān)重要的作用。當(dāng)植物受到外界刺激時(shí)，會(huì)引起Ca2+內(nèi)流[1-2]，Ca2+信號(hào)的強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間與刺激的性質(zhì)有關(guān)[3]。鈣感受器可以接收Ca2+信號(hào)并將其傳遞至下游[4]。

Ca2+感受器主要有鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)、類鈣調(diào)蛋白(CaM-like protein,CML)、鈣依賴型蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase,CDPK)和類鈣調(diào)神經(jīng)素B (calcineurin B-like protein,CBL)[5]。CML是一類重要的鈣離子感受器,含有數(shù)目不等的EF-hand結(jié)構(gòu)域且不具有其他結(jié)構(gòu)域[6]。EF-hand結(jié)構(gòu)由29個(gè)氨基酸組成螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)，位于中心的12個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)與Ca2+結(jié)合相關(guān)的轉(zhuǎn)環(huán)(turn-loop)結(jié)構(gòu)[7-8]。EF-hand結(jié)構(gòu)中的天冬氨酸和谷氨酸與Ca2+結(jié)合，具有高度的保守性[9]。CML參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和多種外界脅迫的響應(yīng)當(dāng)中，對(duì)植物的生長(zhǎng)有著重要的作用[10-12]。

目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了CML基因，如擬南芥中鑒定到50個(gè)CML基因[13]，水稻中有32個(gè)CML基因[14]，番茄含有52個(gè)CML基因[15]，大豆含有144個(gè)CML基因[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)在NaCl處理、低溫處理和脫落酸(ABA)處理下都能誘導(dǎo)擬南芥AtCML9基因的表達(dá)，其中NaCl對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用主要通過ABA介導(dǎo)[17]。AtCML25可以通過調(diào)節(jié)K+內(nèi)流調(diào)控?cái)M南芥花粉萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)[18]。AtCML42參與茉莉酸(JA)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用JA處理Atcml42突變體植株發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了更高的Ca2+內(nèi)流，提高了對(duì)根長(zhǎng)的抑制效果并且降低了食草性昆蟲的取食,表明AtCML42負(fù)調(diào)控植物對(duì)JA的敏感性，進(jìn)而提高了植物對(duì)草食性昆蟲的抗性。此外，干旱脅迫下Atcml42植株的脫落酸含量升高,這表明AtCML42在干旱脅迫下抑制ABA的生物合成[19]。擬南芥AtCML43基因在根尖中特異表達(dá)，在水楊酸(SA)處理后表達(dá)量升高，進(jìn)而調(diào)控植物免疫[20]。在番茄中，CML43參與了對(duì)丁香假單胞桿菌的免疫反應(yīng)[21]。水稻類鈣調(diào)蛋白基因OsMSR2在低溫、干旱和高溫多種環(huán)境脅迫下表達(dá)量均強(qiáng)烈上調(diào)。OsMSR2轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA表現(xiàn)出超敏反應(yīng)，表明OsMSR2通過ABA途徑調(diào)控植株對(duì)干旱和鹽分脅迫響應(yīng)[22]。

馬鈴薯作為主要的糧食作物之一，具有種植范圍廣、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的特點(diǎn)[23-24]。本研究通過對(duì)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選獲得80個(gè)StCML基因，利用生物信息學(xué)分析了StCML家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、基因復(fù)制、RNA-seq表達(dá)譜、GO富集分析和種間共線性，并檢測(cè)了7個(gè)基因在低溫、高溫、鹽脅迫和青枯菌侵染下基因的表達(dá)量，對(duì)StCML表達(dá)分析做了初步研究，對(duì)后續(xù)功能驗(yàn)證提供了思路，也為研究馬鈴薯StCML基因在生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆作用中的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以馬鈴薯Désirée品種為實(shí)驗(yàn)材料。切取長(zhǎng)勢(shì)一致的脫毒苗頂芽放于含有MS培養(yǎng)基的組培瓶中，在植物生長(zhǎng)箱生長(zhǎng)15 d后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件：溫度22 ℃、光照時(shí)間16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度10 000 Lx。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯StCML基因家族成員鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載蛋白序列(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/)，在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載CML家族的結(jié)構(gòu)域模型文件(EF-hand_1：PF00036、EF-hand_6：PF13405、EF-hand_7：PF13499、EF-hand_8：PF13833)，使用HMMER軟件篩選馬鈴薯蛋白序列中含有EF-hand結(jié)構(gòu)域的序列。將篩選到的蛋白序列在Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/search)和SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對(duì)。使用Expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析StCML蛋白的理化特性。

使用MEGA10.1.7軟件將馬鈴薯StCML和擬南芥AtCML蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)，選用Poisson model，進(jìn)行1 000次 bootstrap測(cè)試,AtCML蛋白序列由文獻(xiàn)獲得[13]。

1.2.2 馬鈴薯StCML染色體定位與基因復(fù)制分析在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載基因的gff文件獲取基因位置信息，使用TBtools軟件[25]繪制染色體定位圖。將序列相似性在70%以上且基因間隔在5個(gè)基因以內(nèi)的基因定義為串聯(lián)重復(fù)基因；在植物基因組復(fù)制數(shù)據(jù)庫(kù)PGDD(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)中查找StCML基因的片段復(fù)制基因。

1.2.3 馬鈴薯StCML基因保守基序、基因結(jié)構(gòu)與順式作用元件分析在MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/)在線分析StCML蛋白基序種類及組成。從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載StCML基因外顯子、內(nèi)含子和染色體位置數(shù)據(jù)文件，使用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。選取基因前1 500 bp序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站分析順式作用元件，使用GSDD2.0網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)繪圖。

1.2.4 馬鈴薯StCML基因GO富集與種間共線性分析提交StCML的氨基酸序列到Blast2GO軟件(https://www.blast2go.com/)進(jìn)行GO富集，分析分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組成。

使用perl腳本比對(duì)擬南芥AtCML與馬鈴薯StCML間的共線性基因，比對(duì)參數(shù)設(shè)為E≤10-10。

1.2.5 馬鈴薯StCML基因表達(dá)模式分析與多種脅迫處理在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載StCML基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，刪除所有組織和脅迫下FPKM值均小于1的基因，計(jì)算Log2值并使用TBtools繪制熱圖。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗進(jìn)行脅迫處理：低溫處理將組培苗放入4 ℃植物生長(zhǎng)箱培養(yǎng)6 h；高溫處理組培苗放入35 ℃植物生長(zhǎng)箱培養(yǎng)6 h；鹽脅迫處理在超凈工作臺(tái)內(nèi)將組培苗從培養(yǎng)基取出，轉(zhuǎn)移到含有 150 mmol/L NaCl溶液的組培瓶中(使用dH2O配制并滅菌處理)，放回植物生長(zhǎng)箱培養(yǎng)12 h；青枯菌侵染在超凈工作臺(tái)內(nèi)將組培苗從培養(yǎng)基取出，轉(zhuǎn)移到含有GMI1000菌液(OD600= 0.01)的組培瓶中(使用dH2O配制并滅菌處理)，放回植物生長(zhǎng)箱培養(yǎng)12 h。使用未經(jīng)處理的組培苗作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。低溫、高溫和鹽脅迫處理后，取植物的葉和莖；青枯菌處理后取植物的根系組織，使用液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存。使用Thermo RNA提取試劑盒(#K0801)提取馬鈴薯植株RNA,使用艾科瑞逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11711)合成cDNA,使用QuantStudio 7熒光定量?jī)x進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。定量試劑使用Genestar 試劑盒(A301)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30s，72 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 StCML基因家族鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用CML結(jié)構(gòu)域模型文件，使用HMMER軟件篩選出200個(gè)馬鈴薯蛋白序列，在Pfam網(wǎng)站和SMART網(wǎng)站分析序列的結(jié)構(gòu)域，剔除無(wú)EF-hand結(jié)構(gòu)的序列和含有其他結(jié)構(gòu)域的序列后剩余97個(gè)蛋白，刪除冗余基因和鈣調(diào)蛋白基因后鑒定到80個(gè)StCML基因(表1)。使用Expasy網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白生化特征，發(fā)現(xiàn)StCML蛋白的氨基酸數(shù)量主要在69～344之間，只有3個(gè)StCML蛋白的氨基酸數(shù)量大于500，蛋白分子質(zhì)量主要在8.05～36.52 kD之間，有3個(gè)大于56 kD,等電點(diǎn)在3.69～9.48之間，大部分為酸性(88.75%)。

表1 馬鈴薯StCML基因家族序列特征Table 1 Sequence information of StCML genes in potato

為了分析馬鈴薯StCML基因的進(jìn)化關(guān)系，使用相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，包含擬南芥的50個(gè)AtCML和馬鈴薯的80個(gè)StCML。它們被分為5個(gè)亞家族，每組所含蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)差異不大，分別含有32、24、20、25和29個(gè)蛋白，其中馬鈴薯StCML分別為18、12、14、12和24個(gè)。StCML和AtCML在5個(gè)亞家族中均有分布，StCML數(shù)目多于AtCML可能是馬鈴薯作為四倍體植物的基因組復(fù)雜性所致。

2.2 StCML染色體定位與基因復(fù)制分析

為了確定StCML基因在染色體的分布，在馬鈴薯網(wǎng)站查找了基因位置并繪制染色體定位圖(圖2)。StCML在12條染色體上均有分布，4號(hào)染色體最多，含有12個(gè)基因，8號(hào)染色體最少，只有1個(gè)基因，StCML1-4可能由于在染色體gap區(qū)域附近未被定位到12條染色體上。

StCML中含有13個(gè)串聯(lián)復(fù)制基因，其中2組在4號(hào)染色體，另2組分別在10號(hào)和11號(hào)染色體。StCML中還含有18個(gè)片段復(fù)制基因，其中大部分集中在2號(hào)染色體，有2對(duì)基因均位于2號(hào)染色體，5對(duì)基因中的1個(gè)在2號(hào)染色體。由此推測(cè)StCML基因家族的擴(kuò)張是由串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制共同作用產(chǎn)生的，其中2號(hào)染色體是片段復(fù)制的重要區(qū)域。

薊色為第1亞家族；粉藍(lán)色為第2亞家族；粉紅色為第3亞家族；淺紫色為第4亞家族；淺青色為第5亞家族圖1 馬鈴薯與擬南芥CML基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析The thistle color is the first subfamily;powder blue is the second subfamily;pink is the third subfamily;lavender is the fourth subfamily;and light cyan is the fifth subfamilyFig.1 Phylogenetic relationship of CML genes in Arabidopsis and potato

2.3 StCML基因保守基序、基因結(jié)構(gòu)與順式作用元件分析

CML基因特征為具有EF-hand結(jié)構(gòu)域，使用MEME網(wǎng)站預(yù)測(cè)StCML基序，結(jié)果顯示StCML主要含有5個(gè)保守基序(圖3，A)，它們的長(zhǎng)度在21～33個(gè)氨基酸(表2)。通過查詢Pfam網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)基序Motif 2、Motif 3、Motif 4屬于EF-hand結(jié)構(gòu)域。所有StCML均含有EF-hand結(jié)構(gòu)域，其中除StCML32、StCML40和StCML70外均含有Motif 2；44個(gè)StCMLs中含有Motif 3基序；33個(gè)StCMLs含有Motif 4。Motif 2在5個(gè)亞家族中廣泛分布，Motif 3和Motif 4主要分布在第1、2和4亞家族中，表明這3個(gè)亞家族具有更高的保守性，而不同亞家族間不同的基序結(jié)構(gòu)則可能表明了它們功能的多樣性。

表2 StCML蛋白保守基序信息表Table 2 List of the conserved motifs of StCML proteins

StCML基因結(jié)構(gòu)如圖3，B所示，外顯子數(shù)目在1～14個(gè)之間，其中大部分基因(61個(gè)，76.25%)沒有內(nèi)含子；5個(gè)基因有1個(gè)內(nèi)含子；其余14個(gè)基因含有多個(gè)內(nèi)含子。第1、2和第3亞家族基因結(jié)構(gòu)都較為保守，大部分基因均只有1個(gè)外顯子，其比例分別為88.99%、91.67%和85.71%。第4和第5亞家族基因結(jié)構(gòu)差異較大，表明StCML基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。

左側(cè)比例尺表示染色體長(zhǎng)度，綠色方框表示串聯(lián)重復(fù)基因，紅色連線表示片段復(fù)制基因，染色體藍(lán)色線條表示基因密度圖2 StCMLs染色體定位和基因復(fù)制The scale on the left provides the relative length of chromosomes,green boxes indicate tandem duplicate genes,red lines indicate segmentally duplicate genes,blue lines on chromosomes indicate gene densityFig.2 Chromosomal location and gene duplication of StCMLs

為了研究StCML基因可能受到的調(diào)控機(jī)制，將基因起始密碼子前1 500 bp序列提交到PlantCARE網(wǎng)站預(yù)測(cè)順式作用元件分布，并使用GSDS2.0在線網(wǎng)站繪制順式元件分布圖(圖4)。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)與馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件：調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律元件(circadian)和調(diào)控分生組織表達(dá)元件(CAT-box)；與5種激素相關(guān)的順式作用元件：脫落酸(ABRE)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif)、水楊酸(TCA-element和W-box)、生長(zhǎng)素(TGA-element)、乙烯(ERE)；5個(gè)脅迫響應(yīng)的相關(guān)順式作用元件：缺氧脅迫(ARE)、機(jī)械損傷(WUN-motif)、低溫(MBS)、光照(I-box)和TC-rich repeats反應(yīng)元件。StCML15啟動(dòng)子含有的順式作用元件最多，有20個(gè)，StCML5啟動(dòng)子含有順式作用元件最少，只有2個(gè)。StCML基因共含有126個(gè)ABRE，分布在56個(gè)基因中；含有103個(gè)ARE，分布在58個(gè)基因中；含有97個(gè)ERE，分布在52個(gè)基因中。響應(yīng)逆境的相關(guān)順式作用元件在所有StCML基因中均有分布。順式作用元件分析表明StCML基因可能參與到了植物生長(zhǎng)發(fā)育和多種激素及脅迫響應(yīng)中。

2.4 StCML基因GO富集與種間共線性分析

為了進(jìn)一步了解StCML蛋白功能，使用Blast2GO軟件進(jìn)行了GO富集，分析它們?cè)谏飳W(xué)過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF) 和細(xì)胞成分(Cellular component，CC)中的作用(圖5，A)。由GO富集分析發(fā)現(xiàn)80個(gè)StCML蛋白均具有離子結(jié)合能力(ion binding)，這表明了它們可能具有Ca2+結(jié)合功能。在生物學(xué)過程分析中，發(fā)現(xiàn)27個(gè)蛋白參與了細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)(cellular response to stimulus)，除StCML78外，其余26個(gè)蛋白(StCML1～3、5、6、22～24、27～29、32、33、43、44、46、50、57、58、66、70、73～76、80)還參與了細(xì)胞調(diào)節(jié)(regulation of cellular process)、細(xì)胞通訊(cell communication)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)，其中17個(gè)蛋白(StCML1、5、22、23、27～29、32、33、43、50、57、70、73～76)還參與了細(xì)胞成分的構(gòu)成(cellular component organization or biogenesis)，并且這17個(gè)蛋白在分子功能中具有酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)。具有這些功能的StCML主要分布在第1亞家族和第4亞家族。8個(gè)蛋白(StCML4、6、7、11、27、46、58、66)參與細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)的構(gòu)成，它們與StCML30、StCML47和StCML20共11個(gè)蛋白參與了細(xì)胞器(organelle)和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)(intracellular anatomical structure)的構(gòu)成。根據(jù)結(jié)果推測(cè)StCML在環(huán)境刺激下通過接收Ca2+信號(hào)參與了細(xì)胞調(diào)控并且可能參與了細(xì)胞多個(gè)成分的構(gòu)成。

繪制AtCML和StCML基因共線性圖發(fā)現(xiàn)存在20對(duì)共線性基因(圖5，B)，在5個(gè)亞家族中均有共線性基因分布。馬鈴薯2號(hào)染色體是含共線性基因最多的染色體(7個(gè))；擬南芥3號(hào)染色體含共線性基因最多(6個(gè))。StCML15和StCML21均與AtCML45和AtCML46為共線性基因；StCML19與AtCML23和AtCML24為共線性基因；StCML31與AtCML26和AtCML27為共線性基因。AtCML45與StCML15、StCML21和StCML30是共線性基因。其中StCML15、StCML21和StCML31為片段復(fù)制基因，AtCML23和AtCML24與AtCML26和AtCML27分別為2對(duì)片段復(fù)制基因[13]。這表明了馬鈴薯與擬南芥CML基因具有一定的相似性。

2.5 StCML基因表達(dá)分析

為了研究StCML基因在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)下的表達(dá)，在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站查找StCML基因在不同組織中和多種脅迫下的RNA-seq數(shù)據(jù)并繪制熱圖(圖6)。共統(tǒng)計(jì)了StCML基因在花、葉、葉柄、根、芽、雄蕊、匍匐莖、塊莖、愈傷、花瓣、心皮和萼片中的組織表達(dá)，以及植株在鹽(Salt)、熱(Heat)、6-芐氨基嘌呤(BAP)、甘露醇(Mannitol)、脫落酸(ABA)、生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA3)、晚疫病菌(P.infestans)、β-氨基丁酸(BABA)和苯并噻二唑(BTH)處理下基因的表達(dá)。6個(gè)基因(StCML10、24、25、28、47、71)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)各個(gè)組織中表達(dá)量未被檢測(cè)到，12個(gè)基因(StCML6、10、12、15、20、24、25、26、28、47、71、78)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)多種脅迫處理下未被檢測(cè)到表達(dá)。除去這些表達(dá)量極低的基因，其余基因至少在一個(gè)組織中表達(dá)。特異表達(dá)的組織主要有花、葉柄、芽、雄蕊、匍匐莖和塊莖，分別有8、5、7、12、18和4個(gè)基因特異表達(dá)。StCML基因主要響應(yīng)鹽、熱、干旱和赤霉素處理，分別有13、10、8和9個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào)。

2.6 StCML基因多種脅迫響應(yīng)分析

為了進(jìn)一步研究StCML基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，使用低溫、高溫、鹽和青枯病菌GMI1000處理馬鈴薯材料Désirée進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)StCML基因的表達(dá)，選取7個(gè)在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)量較高且對(duì)鹽和熱脅迫有響應(yīng)的基因(StCML8、11、13、21、39、53、60)作為研究對(duì)象(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4種脅迫處理下均有基因響應(yīng)，且不同基因的表達(dá)存在較大差異。與未處理的植株相比，在低溫脅迫下StCML13、StCML21和StCML53表達(dá)量分別上調(diào)至6.47、6.76和2.47倍；高溫脅迫下StCML11、StCML21和StCML39表達(dá)量分別上調(diào)至3.43、2.43和6.20倍，StCML8和StCML60下調(diào)至0.49和0.29倍；鹽脅迫下StCML21和StCML60表達(dá)量上調(diào)至8.2倍和4.5倍。青枯菌處理下只有StCML53上調(diào)至2.6倍，StCML8、StCML13、StCML21和StCML60分別下調(diào)至0.35、0.03、0.04和0.13倍。StCML21在4種處理下均有響應(yīng)，其他基因也至少在一種處理下表達(dá)量有顯著變化，這表明StCML基因在多種環(huán)境脅迫中都可能具有作用。

下方比例尺表示蛋白長(zhǎng)度(A)和基因長(zhǎng)度(B)圖3 StCML基因家族保守基序(A)及基因結(jié)構(gòu)(B)分析The scales below provide the length of proteins (A) and genes (B) respectivelyFig.3 Conserved motif(A)and gene structure(B)analysis of StCML genes

下方比例尺表示基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度圖4 StCML啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)The scales below provide the length of promotersFig.4 Predicted cis-elements in StCML promoters

圖5 StCMLs蛋白的GO富集分析(A)及擬南芥和馬鈴薯CMLs共線性分析(B)Fig.5 The information of gene ontology of StCMLs(A) and Orthologous relationship of CML genes in Arabidopsis and potato(B)

圖例表示標(biāo)準(zhǔn)化的FPKM值。紅色表示高表達(dá)水平，藍(lán)色表示低表達(dá)水平圖6 StCML基因在不同組織和器官中的表達(dá)譜(A)及多種脅迫下的表達(dá)模式(B)Legends represent the normalized FPKM values.Red means high expression level,while blue means low expression levelFig.6 Expression profiles of StCMLs in different tissues and organs (A) and expression patterns under different stresses(B)

不同小寫字母表示基因表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)圖7 多種脅迫下StCML基因的相對(duì)表達(dá)Different lowercase letters indicate significant difference in gene expression (P<0.05)Fig.7 Relative expression levels of StCML genes under different stresses

3 討 論

本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定到了80個(gè)馬鈴薯StCML基因，StCML具有典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域，在馬鈴薯12條染色體上均有分布。與擬南芥AtCML構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)StCML可分為5個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族都有至少12個(gè)StCML，分布較為均衡。StCML基因家族中分別含有13個(gè)(16.25%)串聯(lián)復(fù)制基因和18個(gè)(22.5%)片段復(fù)制基因?；驈?fù)制事件主要發(fā)生在2號(hào)染色體。擬南芥中含有11個(gè)(22%)串聯(lián)復(fù)制基因和27個(gè)(54%)片段復(fù)制基因[13]。相比之下擬南芥中基因復(fù)制的比例更高。

馬鈴薯StCML基因中61個(gè)(76.25%)基因沒有內(nèi)含子，與之相似的是擬南芥AtCML基因家族中有37個(gè)(74%)基因不含內(nèi)含子[13]，水稻OsCML基因家族中有24個(gè)(75%)基因不含內(nèi)含子[14]，番茄SlCML基因家族中有31個(gè)(59.62%)基因不含內(nèi)含子[15]。有研究表明無(wú)內(nèi)含子或內(nèi)含子較少的基因在植物中可以更快地表達(dá)，這使得植物可以迅速應(yīng)對(duì)外界刺激[26]，這可能是CML基因快速參與調(diào)控的一個(gè)原因。

馬鈴薯StCML與擬南芥AtCML具有20對(duì)共線性基因，每對(duì)共線性基因均在同一亞家族，這表明了StCML同組間基因的保守性。與StCML具有共線性的擬南芥基因已有多個(gè)被報(bào)道。如與StCML49共線性的AtCML5位于高爾基體，參與內(nèi)小泡的運(yùn)輸[27]；與StCML24共線性的AtCML8基因突變體Atcml8在水楊酸和NaCl處理下表達(dá)量均上調(diào)[28]，并且在抵御丁香假單胞桿菌的侵染中發(fā)揮作用[29]；與StCML49共線性的AtCML24和AtCML23共同參與調(diào)控植物對(duì)光照時(shí)間的感知，通過Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)NO的積累，調(diào)控植物開花[30]；與StCML15共線性的AtCML46是植物免疫的負(fù)調(diào)節(jié)因子，負(fù)調(diào)節(jié)水楊酸的積累，雙突變體cml46cml47提高了對(duì)丁香假單胞桿菌的抗性[31]。

通過馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站的RNA-seq數(shù)據(jù)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)StCML基因在多種脅迫下均有響應(yīng)，這與預(yù)測(cè)到的順式作用元件功能相吻合，但不同基因間的表達(dá)具有較大差異。前人研究表明番茄SlCML在低溫、干旱、鹽、脫落酸和乙烯利處理下均有基因響應(yīng)[15];白菜BrCML在高溫脅迫下38個(gè)基因上調(diào)，18個(gè)基因下調(diào)[32]；潘那利番茄SpCML在干旱、鹽和低溫脅迫下根中分別有14、12和21個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，在脫落酸、赤霉素和水楊酸處理下，葉片中分別有24、40和44個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)[33]。這些研究表明CML基因在多種脅迫下均有響應(yīng)，可能參與到多種植物對(duì)脅迫的調(diào)控作用，也印證了StCML基因功能的多樣性。

本研究鑒定了馬鈴薯StCML基因家族成員，通過生物信息學(xué)方法研究了基因的物理特性、家族進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、基因定位和基因復(fù)制等方面，并通過qRT-PCR分析了其在多種環(huán)境脅迫下的表達(dá)。為后續(xù)深入研究StCML基因的功能奠定了基礎(chǔ)，也為尋找脅迫調(diào)控基因提供了參考。