李曉斐，張舒婷，蔣夢(mèng)琦，申 序，霍 雯，林玉玲，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椩谡婧松镏袕V泛存在，是調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的一種重要的組蛋白翻譯后修飾方式。乙?；揎椫饕l(fā)生在組蛋白N末端的賴氨酸殘基上，由組蛋白乙?；?histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同調(diào)控其動(dòng)態(tài)平衡。HDAC可與其他蛋白形成多亞基阻遏復(fù)合物，去除核心組蛋白N端的乙?；鶊F(tuán)，從而使染色質(zhì)發(fā)生凝集作用，達(dá)到抑制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的[1]。植物中HDAC可劃分為RPD3/HDA1、SIR2和HD2三個(gè)亞家族。最早HD2蛋白是從玉米中鑒定出來并分離純化[2]，是植物中特有的一種酸性核磷酸化蛋白，在動(dòng)物和真菌中均未發(fā)現(xiàn)這種酶的存在，其結(jié)構(gòu)不同于RPD3/HDA1和SIR2家族，但是在序列上均與肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶同源[3]，因此在植物中該蛋白具有很高的研究?jī)r(jià)值。目前HD2基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆境脅迫等方面的功能均有報(bào)道。如研究發(fā)現(xiàn)巴西橡膠樹HbHDT1基因可能參與其體細(xì)胞胚發(fā)生[4]；水稻OsHDT702通過參與細(xì)胞分裂或增殖調(diào)節(jié)植株的葉片寬度[5]；擬南芥HDT1和HDT2通過調(diào)控miR165/166表達(dá)水平來調(diào)控葉片極性[6]；且研究發(fā)現(xiàn)HD2在擬南芥合子胚及體細(xì)胞胚發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[7]。HD2不僅調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，在激素應(yīng)答、抗逆境脅迫等方面也發(fā)揮重要作用。如擬南芥中，HD2C與HDA6發(fā)生互作，并通過組蛋白修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而影響植株對(duì)ABA和NaCl的敏感性[8]；過表達(dá)AtHD2D的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、鹽和寒冷等非生物脅迫表現(xiàn)出更高的耐受性[9]；小麥中HD2基因在挑旗期和抽穗期的熱脅迫響應(yīng)過程發(fā)揮重要作用[10]。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)是無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)亞熱帶名貴果樹，在中國主要分布于福建、臺(tái)灣、廣西、廣東、四川、貴州、云南等省區(qū)，與荔枝、香蕉、菠蘿同為“華南四大珍果”。龍眼胚胎發(fā)育狀況嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)[11]，自然條件下，合子胚取樣困難等因素限制了對(duì)龍眼胚胎發(fā)育的研究，而龍眼體胚發(fā)生體系的建立是對(duì)龍眼生理生化及開展分子機(jī)制研究的理想模型[12]。本研究結(jié)合前期對(duì)龍眼HD2亞家族2個(gè)基因DlHDT1和DlHDT3在龍眼體胚發(fā)生過程和激素脅迫響應(yīng)的表達(dá)模式鑒定[13]，篩選出最有可能參與龍眼體胚與非生物脅迫響應(yīng)的組蛋白去乙酰化酶基因?yàn)镈lHDT1，因此，將DlHDT1作為本研究的目的基因，對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)克隆驗(yàn)證、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)、非胚性及胚性培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、亞細(xì)胞定位，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為研究龍眼胚胎發(fā)育過程中DlHDT1的調(diào)控機(jī)制提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)以福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長(zhǎng)期繼代保存的‘紅核子’龍眼胚性愈傷組織(embryonic callus,EC)為起始材料[14]，參照賴鐘雄[15]的培養(yǎng)方法，在MS培養(yǎng)基上分別添加0.1和0.5 mg·L-12,4-D，黑暗條件培養(yǎng)20 d，EC分別分化為不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(incomplete compact pro-embryogenic,ICpEC)及球形胚(Globular embryos,GE)。

每瓶接種0.2 g龍眼EC，用不同濃度(0、25、50、100 mmol·L-1)NaCl處理，置于25 ℃、110 r/min、黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h；同時(shí)，采用10%聚乙二醇(PEG6000)滲透調(diào)節(jié)劑模擬干旱脅迫處理，置于25 ℃、110 r/min、黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)0、4、8 和12 h，分別收樣液氮冷凍，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄按照Transzol up試劑盒說明書(全式金，中國)分別提取龍眼EC、ICpEC、GE階段及NaCl和PEG6000處理的RNA，取EC、ICpEC、GE階段的RNA各取1 μL混

合，然后采用TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR試劑盒(全式金，中國)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA供克隆使用；采用Hifair?Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翊圣，中國)進(jìn)行NaCl和PEG6000處理下的cDNA合成供qRT-qPCR使用。

1.2.2DlHDT1基因CDS全長(zhǎng)序列的獲得與驗(yàn)證選取擬南芥HD2氨基酸序列，經(jīng)龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(NCBI 登錄號(hào)為PRJNA305337)同源比對(duì)，篩選注釋共獲取5條DlHD2候選序列(Dlo_031412.1、Dlo_030193.1、Dlo_023309.2、Dlo_026619.1、Dlo_000805.1)。采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件對(duì)候選序列進(jìn)行鑒定，篩選出具有完整保守結(jié)構(gòu)域的成員共2條(Dlo_031412.1和Dlo_030193.1)；采用NCBI Blast同源比對(duì)參照其他物種的共同命名方法，將DlHD2成員分別命名為DlHDT1和DlHDT3[13]，通過前期的數(shù)據(jù)分析選擇對(duì)DlHDT1進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證以及后續(xù)分析。

利用DNAMAN軟件在CDS序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，將引物序列送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。以1.2.1中逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL：2×Trans-

Start?FastPfu PCR SuperMix(-dye) 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸51 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)目的片段，利用GeneJET Plasmid Miniprep Kit試劑盒(賽默飛世爾科技，美國)進(jìn)行目的片段的回收。將膠回收產(chǎn)物與Bzero載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金，中國)，過夜培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后，挑選陽性克隆子送至上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析采用ExPASy (https://www.expasy.org/)對(duì)DlHDT1氨基酸序列進(jìn)行蛋白基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；采用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；采用Plantcare(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式作用元件；采用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)N端信號(hào)肽；采用NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ NetPhos/)預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；采用EMBnet TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；采用MEME(Multiple expectation maximization for motif elicitafion)預(yù)測(cè)保守基序(motif)，然后在TBtools中進(jìn)行可視化。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用NCBI對(duì)DlHDT1的蛋白序列進(jìn)行blast分析，下載包含龍眼在內(nèi)的19種親緣關(guān)系較近植物的HDT1蛋白序列，在MEGA7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰近法(neighbor-joining method)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，Bootstrap設(shè)置1 000次重復(fù)，其它參數(shù)為默認(rèn)值，利用在線工具iTOL(https://itol.embl.de/upload.cgi)對(duì)其進(jìn)行美化。

1.2.5 DlHDT1蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析參考擬南芥基因互作網(wǎng)絡(luò)利用在線軟件STRING(https://string-db.org)選擇k均值聚類算法進(jìn)行聚類分析，最低互動(dòng)評(píng)分設(shè)置為medium confidence(0.400)，預(yù)測(cè)DlHDT1與其他蛋白之間的互作關(guān)系。

1.2.6 蛋白亞細(xì)胞定位根據(jù)Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊，中國)引物設(shè)計(jì)方法，分別設(shè)計(jì)帶有線性化1302表達(dá)載體末端15 bp同源序列的上下游特異性引物DlHDT1-1302-F和DlHDT1-1302-R(表1)，通過PCR擴(kuò)增目的基因，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和BcuⅠ對(duì)1302載體進(jìn)行雙酶切，然后參照Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit方法對(duì)目的片段和線性化1302載體進(jìn)行重組，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸肝菌Trans-T1，活化后涂布于含有卡那抗生素(50 mg·L-1)的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)并篩選單克隆進(jìn)行菌液PCR，測(cè)序正確后提取pCAMBIA1302-DlHDT1-GFP重組質(zhì)粒，采用凍融法將pCAMBIA1302-35S-GFP空載及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥內(nèi)表皮并進(jìn)行DlHDT1蛋白亞細(xì)胞定位觀察。

表1 引物序列Table 1 List of primers used

1.2.7DlHDT1基因在龍眼體胚發(fā)生過程及脅迫處理下的表達(dá)模式分析結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析‘紅核子’龍眼在非胚性培養(yǎng)物(NEC)和胚性培養(yǎng)物(EC、ICpEC和GE)階段的FPKM值(SRA:PRJNA565345)；利用DNAMAN對(duì)DlHDT1序列進(jìn)行qRT-PCR特異性引物設(shè)計(jì)(表1)，分別以ACTB和UBQ為PEG6000和NaCl處理下的內(nèi)參基因[16]，使用LightCycler480儀器進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，用2-ΔΔCt法計(jì)算DlHDT1的相對(duì)表達(dá)量，然后采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，最后用Excel和Graphpad數(shù)據(jù)處理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼DlHDT1基因CDS序列克隆及生物信息學(xué)分析

以DlHDT1-F和DlHDT1-R為上下游引物，用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增得到918 bp目的片段(圖1)，其編碼305個(gè)氨基酸；利用克隆得到的DlHDT1的CDS序列與DlHDT1(Dlo_030193.1)基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，相似性為99.78%，說明成功克隆獲得DlHDT1基因。

利用ExPASy在線軟件對(duì)DlHDT1編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為43.99，親水性為-1.035，氨基酸個(gè)數(shù)為305 aa，等電點(diǎn)為4.65，相對(duì)分子質(zhì)量為32 585.54 Da。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示定位于細(xì)胞核中。SignalP預(yù)測(cè)顯示該蛋白不含信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白。該蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示共有43個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser)修飾位點(diǎn)有23個(gè)，蘇氨酸(Thr)修飾位點(diǎn)8個(gè)，酪氨酸(Tyr)修飾位點(diǎn)1個(gè)。

2.2 HDT1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及motif分析

利用NCBI BLAST對(duì)龍眼HDT1的氨基酸序列進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果顯示該蛋白與漾濞槭、開心果、甜橙、克里曼丁橘相似度較高，分別為78.76%、70.87%、69.97%、69.9%，說明HDT1在進(jìn)化中保守性較高。選擇并下載與DlHDT1相似度較高的18種植物的氨基酸序列，利用MEGA7軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示(圖2)，HDT1蛋白主要分為3個(gè)分支，不同分支的HDT1可能具有不同的起源。

M.DNA marker圖1 DlHDT1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of DlHDT1 gene

對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)化樹中不同物種蛋白質(zhì)的保守基序(motif) 進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)顯示，所有物種都有motif 1、motif 5、motif 6、motif 8、motif 9 這5個(gè)保守基序；此外，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系相近的植物基序結(jié)構(gòu)相似度較高，如龍眼與漾濞槭處于同一分支，二者均含motif 20；克里曼丁橘和甜橙處于同一分支，二者均含motif 13；說明與DlHDT1親緣關(guān)系相近的物種結(jié)構(gòu)具有相似性，進(jìn)一步推測(cè)其功能也可能相近。

圖2 龍眼與其他植物的HDT1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HDT1 in longan and other plants

2.3 龍眼DlHDT1基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

提取DlHDT1基因起始密碼子ATG上游2 000 bp區(qū)域，采用Plantcare對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果表明(圖3)：該基因啟動(dòng)子除了含有CAAT-box和TATA-box必需元件外，還有光響應(yīng)元件9個(gè)，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件4個(gè)，厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件3個(gè)，脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、低溫、干旱、缺氧特異性、胚乳發(fā)育響應(yīng)元件均各為1個(gè)。

A.光;B.茉莉酸甲酯;C.厭氧;D.生長(zhǎng)素;E.干旱;F.胚乳;G.赤霉素;H.脫落酸;I.低溫;J.富含AT的DNA結(jié)合蛋白圖3 DlHDT1啟動(dòng)子順式作用元件分布A.Light;B.MeJA;C.Anaerobic;D.Auxin;E.Drought;F.Endosperm;G.Gibberellin;H.Abscisic acid;I.Low temperature;J.ATBP-1 binding siteFig.3 Promoter cis-acting element distribution of DlHDT1

2.4 龍眼DlHDT1蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

String數(shù)據(jù)庫是基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)、文本挖掘以及生信分析(基因臨近、融合、共表達(dá)、同源性)進(jìn)行評(píng)分，預(yù)測(cè)蛋白間互作情況。本研究以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參考，利用String預(yù)測(cè)DlHDT1蛋白與其他蛋白間的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

聚類預(yù)測(cè)顯示(圖4)，DlHDT1[AtHDT2(AtHD2B)]蛋白與其他蛋白存在互作關(guān)系并形成2個(gè)分支，第一支與HD1蛋白發(fā)生互作，HD1與HDT1均屬于組蛋白去乙酰化酶蛋白；第二支與HDA3、FIB2、NOP56、RPS6A、NUC-L1發(fā)生互作，這些蛋白主要與RNA加工、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖等功能相關(guān)。說明DlHDT1蛋白除與自身家族成員發(fā)生互作外，還可以與其他蛋白發(fā)生互作，預(yù)測(cè)與DlHDT1蛋白互作關(guān)系較強(qiáng)的蛋白可能與其具有功能相關(guān)性。

圖4 以擬南芥為參考構(gòu)建DlHDT1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Interaction network of DlHDT1 proteins based on Arabidopsis thaliana association model

2.5 龍眼 DlHDT1蛋白的亞細(xì)胞定位

WoLF PSORT在線網(wǎng)站對(duì)DlHDT1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞核，與擬南芥中的定位結(jié)果一致[7]，這一定位結(jié)果與組蛋白去乙?；改軌蛟诮M蛋白末端的賴氨酸殘基上發(fā)揮脫乙?；揎椀淖饔孟嚓P(guān)。將構(gòu)建好含有DlHDT1與GFP 融合蛋白載體的農(nóng)桿菌注射到洋蔥內(nèi)表皮，將其置于28 ℃的暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的定位情況。結(jié)果顯示：在導(dǎo)入pCAMBIA1302-GFP空載的洋蔥表皮細(xì)胞，GFP熒光幾乎充斥整個(gè)細(xì)胞中(圖5，D-F)；而導(dǎo)入含目的基因DlHDT1融合蛋白的洋蔥表皮細(xì)胞，僅在細(xì)胞核中呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)(圖5，A-C)，進(jìn)而驗(yàn)證了DlHDT1蛋白定位于細(xì)胞核。

2.6 龍眼DlHDT1在體胚發(fā)生過程及干旱和鹽脅迫處理下的表達(dá)模式

2.6.1DlHDT1在龍眼體胚發(fā)生過程的FPKM值分析龍眼體胚發(fā)生過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：DlHDT1在非胚性愈傷組織(NEC)向球形胚(GE)發(fā)育過程中均檢測(cè)到表達(dá)且FPKM值高于300，其中在球形胚GE階段FPKM最高為810.64(圖6)，因此推測(cè)DlHDT1可能有利于非胚性及胚性培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其有利于球形胚GE發(fā)生。

2.6.2DlHDT1在干旱和鹽脅迫處理下的qRT-PCR分析利用qPCR技術(shù)檢測(cè)10%的PEG6000在不同時(shí)間處理下DlHDT1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比(0 h)，DlHDT1基因在4、8和12 h 不同處理下均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)(圖7，A)，雖在處理8 h時(shí)其表達(dá)略有上調(diào)，但總體仍為負(fù)調(diào)控趨勢(shì)。在不同濃度NaCl處理下DlHDT1基因呈現(xiàn)“V”型表達(dá)趨勢(shì)，在NaCl濃度為25 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)最低，在NaCl濃度為100 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)最高，但與對(duì)照組相比也為負(fù)調(diào)控趨勢(shì)(圖7，B)，由此推測(cè)DlHDT1參與鹽脅迫及干旱脅迫過程，并存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

A-C.導(dǎo)入DlHDT1基因融合表達(dá)載體的洋蔥表皮細(xì)胞；D-F.導(dǎo)入pCAMBIA1302-35S-GFP 空載體的洋蔥表皮細(xì)胞；A、D 為熒光激發(fā)圖；B、E 為明場(chǎng)圖；C、F 為疊加圖圖5 DlHDT1蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位A-C.Onion epidermal cells introduced with 1302 vector with DlHDT1 gene;D-F.Onion epidermal cells introduced with pCAMBIA1302-35S-GFP empty vector;A and D were shot in flourescent field;B and E were shot in bright field;C and F were shot in merged fieldFig.5 Subcellular localization of DlHDT1 protein in onion epidermal cells

NEC.非胚性愈傷組織；EC.胚性愈傷組織；ICpEC.不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)；GE.球形胚圖6 龍眼胚性及非胚性培養(yǎng)物DlHDT1的FPKM值NEC.Nonembryogenic callus;EC.Embryogenic callus;ICpEC.Incomplete embryotic compacted structure;GE.Spherical embryoFig.6 FPKM value of DlHDT1 at non-embryogenic and embryogenic cultures in longan

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著圖7 不同脅迫處理下DlHDT1的相對(duì)表達(dá)量Different normal letters indicate significant differences between treatments at 0.05 levelFig.7 Relative expression of DlHDT1 under different treatments

3 討 論

3.1 龍眼DlHDT1蛋白定位于細(xì)胞核

HD2亞家族最初是在玉米中鑒定出來[2]，目前已在水稻[17]、擬南芥[18]、甜橙[19]等植物中鑒定出HD2亞家族基因。本研究基于龍眼基因組數(shù)據(jù)庫克隆得到DlHDT1的CDS序列為918 bp，該基因隸屬于HD2亞家族，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示DlHDT1為不穩(wěn)定、親水的酸性蛋白，無信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，含豐富的蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化修飾位點(diǎn)，推測(cè)它與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育等諸多生物學(xué)問題有密切關(guān)系。蛋白質(zhì)在核糖體完成生物合成后只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的細(xì)胞器或區(qū)域中才能發(fā)揮作用[20]，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究對(duì)于解析蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控，理解細(xì)胞生理活動(dòng)機(jī)制具有重要意義。為研究DlHDT1蛋白的亞細(xì)胞定位情況，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮后共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明DlHDT1蛋白定位于細(xì)胞核中，這與水稻[5]、毛果楊[21]中定位結(jié)果一致。

3.2 龍眼DlHDT1可能參與體胚發(fā)生及非生物脅迫響應(yīng)

HD2作為植物特有的一種組蛋白去乙?；福瑥V泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程。如參與擬南芥根的生長(zhǎng)，過表達(dá)AtHD2D植株側(cè)根生長(zhǎng)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株的根冠比高于野生型[9]。參與擬南芥種子發(fā)育，沉默AtHD2A基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植物種子敗育[22]；HD2A可通過葡萄糖信號(hào)傳導(dǎo)途徑在擬南芥幼苗萌發(fā)的早期發(fā)揮重要作用[23]。SlHDT3基因通過調(diào)控番茄果實(shí)中類胡蘿卜素及乙烯生物合成影響番茄紅素的積累及番茄果實(shí)成熟[24]。植物中HD2蛋白從玉米胚中被分離純化出來，且在玉米胚胎的早期形成過程中HD2蛋白以酸性核仁磷酸化形式存在于核內(nèi)，可能參與調(diào)節(jié)核糖體染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[25]。擬南芥中HD2家族有4個(gè)成員，HD2A、HD2B和HD2C在胚珠、胚乳中表達(dá)量較高[22]，說明HD2家族基因可能參與植物胚胎發(fā)育過程。本研究通過分析DlHDT1在龍眼體胚發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，顯示DlHDT1基因在龍眼體胚發(fā)生NEC、EC、ICpEC和GE階段均有表達(dá)，且在GE階段表達(dá)量最高，綜上推測(cè)DlHDT1可能參與龍眼體胚發(fā)生形態(tài)建成。

HDT1在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程、抗逆境脅迫等方面均發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)DlHDT1基因的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子序列含低溫、干旱等逆境脅迫相關(guān)作用元件，推測(cè)DlHDT1可能在極端溫度及干旱等逆境脅迫中起著重要作用。在水稻中過表達(dá)HD2亞家族基因OsHDT701增強(qiáng)了幼苗期植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[26]；擬南芥中HD2D轉(zhuǎn)基因植株通過增加側(cè)根數(shù)量來獲取更多的養(yǎng)分和水分而響應(yīng)干旱脅迫[9]。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)DlHDT1在NaCl及干旱脅迫下表達(dá)模式，結(jié)果顯示DlHDT1基因均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，與楊樹中HD2亞家族基因在NaCl和干旱脅迫處理下表達(dá)趨勢(shì)一致[27]，推測(cè)干旱及鹽脅迫與龍眼體胚發(fā)生早期DlHDT1基因表達(dá)存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。擬南芥HD2蛋白可以與其他蛋白發(fā)生互作，進(jìn)而共同參與脅迫響應(yīng)，如AtHD2C與含BRM的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物發(fā)生互作，形成去乙?；瘡?fù)合體，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄從而響應(yīng)逆境脅[28]。本研究通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示DlHDT1可與多種蛋白發(fā)生互作，DlHDT1的表達(dá)受到干旱和鹽脅迫的調(diào)控，由此我們進(jìn)一步推測(cè)DlHDT1基因可能在龍眼適應(yīng)非生物脅迫過程中具有重要作用，但在蛋白層面DlHDT1如何與蛋白互作參與脅迫調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

本研究從龍眼基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選并克隆出組蛋白去乙?；富駾lHDT1的CDS序列，亞細(xì)胞定位顯示該基因定位于細(xì)胞核，表達(dá)模式分析顯示DlHDT1基因可能參與龍眼體胚發(fā)生的形態(tài)建成，且響應(yīng)干旱及NaCl脅迫應(yīng)答。