朱珍花，蔣芳玲，文軍琴，石瀟瀑，吳翠云，劉 敏，吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

高溫對(duì)植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量均造成不利影響，為此植物進(jìn)化形成相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors，Hsfs)和熱激蛋白(heat shock proteins，Hsps)是高溫脅迫響應(yīng)機(jī)制的重要組成部分。Hsfs通過調(diào)控自身及靶基因的轉(zhuǎn)錄水平來響應(yīng)高溫脅迫[1]。HSP在復(fù)原熱激變性蛋白質(zhì)以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量方面起關(guān)鍵作用。活性氧(ROS)是高溫脅迫引起的應(yīng)激信號(hào)分子[1]。植物中的ROS水平會(huì)影響Hsfs和Hsps的表達(dá)，從而對(duì)高溫脅迫做出響應(yīng)[2-3]。ROS信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子ZAT10和ZAT12參與高溫逆境調(diào)節(jié)[4-5]。這些發(fā)現(xiàn)表明高溫信號(hào)和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間是相互關(guān)聯(lián)的?；钚匝?ROS)清除酶是熱激誘導(dǎo)的主要功能蛋白，包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸酶(APX)等，它們?cè)诟邷孛{迫下清除植物體內(nèi)過量產(chǎn)生的ROS，從而減輕植物遭受的氧化傷害[1,6]。除了Hsf和ZAT兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族外，目前報(bào)道參與高溫逆境脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族還包括NAC、ERF、WRKY、bZIP和MYB等[7]。

GRAS是植物體內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，包括3個(gè)初始成員GAI(gibberellin-acid insensitive)、RGA(the repressor of GA1-3 mutant)和SCR(scarecrow)，這3個(gè)成員的表達(dá)產(chǎn)物具有高度的結(jié)構(gòu)和序列相似性，因此GRAS家族就取GAI、RGA、SCR的關(guān)鍵字母進(jìn)行命名[8]。GRAS在植物發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，包括芽分生組織狀態(tài)維持[9]，腋芽分生組織進(jìn)化[10]，配子發(fā)生[11]，植物鉻信號(hào)以及葉綠素a和b信號(hào)傳導(dǎo)[12]，植物休眠[13]，赤霉素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]，生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]等。GRAS家族基因在植物抵抗非生物脅迫方面也具有重要作用。研究表明，胡楊GRAS家族基因PeSCL7在擬南芥中的過表達(dá)株系表現(xiàn)出更好的耐旱性和耐鹽性[16]；過表達(dá)OsGRAS23水稻株系的耐旱和抗氧化能力均有增強(qiáng)[17]；葡萄GRAS家族基因VaPAT1在擬南芥中的過表達(dá)株系抗旱性、抗冷性和耐鹽性均增強(qiáng)[18]；轉(zhuǎn)核桃JrGRAS2基因酵母在36 ℃脅迫下表現(xiàn)出更高的生存活性[19]。然而GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子是否參與植物高溫逆境調(diào)控還缺少研究，其調(diào)控機(jī)理更少有報(bào)道。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是重要的蔬菜作物，因其果實(shí)具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛并在全球范圍內(nèi)廣泛栽培。番茄喜溫暖，但對(duì)高溫敏感。番茄中有53個(gè)GRAS家族成員[20]，前人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定了該家族部分成員在番茄逆境調(diào)控中的功能。研究表明，沉默SlGRAS6提高了由丁香假單胞菌引起的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的發(fā)病率[21]；沉默SlGRAS43番茄植株在干旱脅迫下丙二醛含量上升，脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性下降[22]；SlGRAS40過表達(dá)株系增強(qiáng)了番茄耐鹽和抗旱能力[23]；SlGRAS7過表達(dá)番茄株系表現(xiàn)出更高的抗旱性和耐鹽性[24]。目前，還未見GRAS家族成員基因參與番茄耐熱調(diào)控的報(bào)道。

在之前研究中，Wen等[25]以醋栗番茄LA2093為材料通過RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)SlGRAS4基因在高溫脅迫后顯著誘導(dǎo)表達(dá)，推測該基因參與番茄高溫脅迫響應(yīng)，并且可能在番茄高溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為分析SlGRAS4基因特征，明確其在番茄耐熱中的作用，本研究首先利用生物信息學(xué)分析法預(yù)測了SlGRAS4生物功能，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測其在逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)特征，最后利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)抑制該基因在番茄植株中的表達(dá)，測定高溫處理下相關(guān)生理指標(biāo)和基因表達(dá)量變化。鑒定SlGRAS4基因在番茄中的耐熱功能，不僅證明了GRAS基因家族與番茄耐熱之間的聯(lián)系，而且豐富了番茄耐高溫調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

試驗(yàn)材料為醋栗番茄LA2093(SolanumpimpinellifoliumL.)，種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。番茄種子經(jīng)過浸泡和催芽處理后播種于基質(zhì)配比為泥炭∶蛭石∶珍珠巖(V∶V∶V)=2∶1∶1的72孔穴盤中，并放置在光培箱中培養(yǎng)(東南儀器，RDN-560E-4，中國)，生長條件為溫度25 ℃/18 ℃(晝/夜)、光周期14 h/10 h(晝/夜)、光合有效輻射為360 μmol·m-2·s-1、相對(duì)濕度75%，沉默植株侵染后溫度調(diào)整為22 ℃/18 ℃(晝/夜)。當(dāng)?shù)?片真葉完全展開后，將生長一致的幼苗移栽到32孔穴盤中，其中不同脅迫和激素處理的番茄幼苗經(jīng)過洗根后移栽至無土栽培基質(zhì)[蛭石∶珍珠巖(V∶V)=1∶1]中，試驗(yàn)材料均澆1倍的田園式營養(yǎng)液。

1.2 方 法

1.2.1SlGRAS4生物信息學(xué)分析利用在線網(wǎng)站Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)比對(duì)SlGRAS4基因組DNA和全長cDNA，得到內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)圖。SlGRAS4蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)等通過在線計(jì)算工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)獲得。SlGRAS4蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果利用在線網(wǎng)站InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)獲取。利用PlantCare數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.Psb.Ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)SlGRAS4基因起始密碼子上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp同源比對(duì)工具，搜索并下載SlGRAS4同源蛋白序列。利用DNAMAN8對(duì)SlGRAS4及其同源蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建簡單進(jìn)化樹。通過在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/took/meme)獲得SlGRAS4及其同源蛋白保守基序。

1.2.2SlGRAS4在不同脅迫和激素處理下的表達(dá)分析LA2093生長至5葉1心時(shí)進(jìn)行不同脅迫和激素處理。對(duì)照為蒸餾水2 L；PEG6000模擬缺水脅迫處理：蒸餾水2 L +20% PEG6000；NaCl模擬鹽脅迫處理：2 L蒸餾水+200 mmol/L NaCl；ABA處理：2 L蒸餾水+200 μmol/L ABA；SA處理：2 L蒸餾水+200 μmol/L SA。分別在處理0、4、8和12 h后取番茄幼苗自頂部向下數(shù)第2片完全展開真葉，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取2株混樣，每次取樣后的植株不再用于重復(fù)取樣，取樣后利用液氮速凍并保存至-80 ℃超低溫冰箱。

利用Trizol 試劑盒(Invitrogen，美國)提取各樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣本完整性，NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(jì)測定其濃度及純度。利用5×All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Abm，加拿大)完成 cDNA 合成和純化。SlGRAS4的qPCR引物(表1)引用于qPrimerDB數(shù)據(jù)庫(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)。利用TOROGreen?qPCR Master Mix 試劑盒(Toroivd，英國)在Quantstudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上按說明進(jìn)行PCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系：5 μLTOROGreen?qPCR Master Mix，1 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL，3.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行熔解曲線分析，范圍為60～95 ℃，以驗(yàn)證每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增特異性。Actin作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCT計(jì)算SlGRAS4基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 VSlGRAS4植株獲取利用Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)中VIGS Tool工具選取SlGRAS4基因CDS區(qū)500 bp序列作為沉默片段，利用諾唯贊公司(南京，中國)CE Design V1.04軟件單片段克隆法設(shè)計(jì)正反向5′端引入線性化載體兩末端同源序列的引物(表1)，以LA2093葉片的cDNA為模板克隆該沉默片段并測序。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ-HF和KpnⅠ(NEB，中國)將TRV2載體線性化，利用同源重組試劑盒Clone Express Ⅱ One Step Cloning Kit(諾唯贊，南京)將其與測序結(jié)果正確的SlGRAS4沉默序列連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌落經(jīng)PCR鑒定后，進(jìn)一步測序獲得正確陽性克隆。提取陽性克隆中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，即得到陽性工程菌。分別將農(nóng)桿菌pTRV1、pTRV2、pTRV2-SlGRAS4單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并重懸于滲透緩沖液(10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、200 μmol·L-1AS，pH5.6)中，調(diào)節(jié)緩沖液中菌液OD600為1.0，室溫黑暗靜置3 h。將含有pTRV1農(nóng)桿菌的滲透液分別與含有pTRV2、pTRV2-SlGRAS4農(nóng)桿菌的滲透液按1∶1比例混合配置成侵染液。待醋栗番茄LA2093幼苗第1片真葉顯現(xiàn)時(shí)，用1 mL注射器將配置好的侵染液注射到番茄子葉中。其中pTRV1農(nóng)桿菌和pTRV2農(nóng)桿菌混合侵染植株作為對(duì)照植株(V-empty，Ve)，pTRV1農(nóng)桿菌和pTRV2-SlGRAS4農(nóng)桿菌混合侵染植株作為沉默植株(VSlGRAS4)，并于接種第20天取第2片葉檢測SlGRAS4的表達(dá)量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 VSlGRAS4植株耐高溫能力鑒定Ve植株和VSlGRAS4植株生長至5葉1心時(shí)，對(duì)其進(jìn)行高溫(40 ℃/40 ℃，晝/夜)處理和相關(guān)指標(biāo)測定。在高溫處理0、12、24 h時(shí)，從上往下數(shù)取第3片葉測定過氧化氫(H2O2)含量和光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，取第4片葉測定電導(dǎo)率(REL)；在高溫處理0、4、8 h時(shí)，從上往下數(shù)取第2片葉測定基因表達(dá)量，取第3片葉測定SOD、POD、APX活性。REL和Fv/Fm測定使用新鮮樣品，其他樣品取樣后立即用液氮速凍并儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱。各項(xiàng)指標(biāo)測定均≥3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取2株混樣，每次取樣后的植株不再用于重復(fù)取樣。

REL的測定參照Cao等報(bào)道的方法[26]；Fv/Fm利用便攜式熒光儀測量；H2O2含量測定參照Uchida等報(bào)道的方法[27]。SOD、POD和APX活性測定參照Beyer和Nakano等報(bào)道的方法[28-29]。

1.2.5 VSlGRAS4植株高溫和ROS信號(hào)應(yīng)答基因表達(dá)量分析將樣品從超低溫冰箱中取出，參考1.2.2 方法完成總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，Actin作為內(nèi)參基因，高溫信號(hào)應(yīng)答基因HsfA1a、HsfA1b、Hsp90和ROS信號(hào)應(yīng)答基因ZAT10、ZAT12、CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1、APX2定量引物引用于qPrimerDB數(shù)據(jù)庫(表1)。利用上述相同PCR體系和程序完成試驗(yàn)，通過2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SE。利用SPSS(25.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlGRAS4生物信息學(xué)分析

為研究SlGRAS4基因特征和生物功能，本研究對(duì)SlGRAS4進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。SlGRAS4前體mRNA通過不同的剪接方式產(chǎn)生兩條成熟mRNA。mRNA1沒有內(nèi)含子，CDS長度為2 000 bp；mRNA2在5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)區(qū)有一個(gè)內(nèi)含子，CDS長度為1 928 bp，mRNA2是與mRNA1編碼序列完全相同的一段序列(圖1，A)，因此本研究僅對(duì)mRNA1編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。SlGRAS4蛋白長度為666 aa，分子量為75 737.72 Da，理論等電點(diǎn)為6.31，含有GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族典型的結(jié)構(gòu)域，主要集中在C末端的277～657 aa之間(圖1，B)。利用PlantCare數(shù)據(jù)庫檢測到SlGRAS4啟動(dòng)子區(qū)域的多種逆境響應(yīng)元件，包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE，茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，傷口響應(yīng)元件WUN-motif等(圖1，C)。利用NCBI查找SlGRAS4同源蛋白序列，發(fā)現(xiàn)SlGRAS4與煙草NtGRAS1(Nicotianatabacum)、麻風(fēng)樹JcGRAS05(jatrophacurcas)、楊樹PtSCL14(Populus)、擬南芥AtSCL14(Arabidopsisthaliana)蛋白具有相似性，其中與NtGRAS1蛋白親緣關(guān)系最近，同源序列主要集中在C端，包含3個(gè)保守基序(conserved motif)(圖2，A-C)，由此推測SlGRAS4可能與其同源基因具有相似的生物功能。

2.2 SlGRAS4在不同逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)分析

為了探究SlGRAS4非生物脅迫響應(yīng)功能，本研究分析了SlGRAS4在不同非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)水平。在高溫、低溫、干旱和鹽脅迫以及ABA和SA激素處理下，SlGRAS4均被誘導(dǎo)表達(dá)。SlGRAS4在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫處理12 h內(nèi)表達(dá)量不斷上升，且在處理12 h時(shí)表達(dá)量升至最高，分別增加到對(duì)照的8.86、4.86、55.38和7.63倍。SlGRAS4在ABA和SA激素處理12 h內(nèi)表達(dá)量先上升后下降，且在處理8 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，分別增加到對(duì)照的120.72和3.55倍(圖3)。這說明SlGRAS4可能參與了多種非生物脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)傳導(dǎo)。

圖3 SlGRAS4在不同非生物脅迫和激素處理下表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of SlGRAS4 gene under different abiotic stress and hormone treatments

2.3 沉默SlGRAS4降低了番茄耐高溫脅迫能力

PCR擴(kuò)增條帶和大腸桿菌菌落PCR鑒定結(jié)果均為500 bp左右，與目標(biāo)SlGRAS4沉默片段(527 bp)大小相一致(圖4，A)，經(jīng)測序確認(rèn)正確并進(jìn)行特異性分析后獲得陽性工程菌。取7株五葉一心的VSlGRAS4植株進(jìn)行沉默效率檢測，相對(duì)于Ve植株，VSlGRAS4植株中SlGRAS4表達(dá)量均有不同程度的下降，下降范圍在34%～82%之間(圖4，B)，這說明SlGRAS4基因被有效沉默。

為了研究沉默SlGRAS4基因?qū)Ψ涯透邷孛{迫能力的影響，本研究檢測了高溫脅迫下VSlGRAS4和Ve植株表型以及生理指標(biāo)變化。取VSlGRAS4和Ve植株各8株進(jìn)行表型差異分析，分別在高溫處理前和二者表型出現(xiàn)差異時(shí)拍照記錄。高溫處理36 h時(shí)，Ve植株正常生長，VSlGRAS4植株葉片高度聚攏，部分葉片出現(xiàn)萎蔫，表現(xiàn)出高溫傷害癥狀(圖5，A)。VSlGRAS4和Ve植株的各項(xiàng)生理指標(biāo)在正常溫度下均無顯著性差異(圖5，B-G)。高溫處理12 h時(shí)，VSlGRAS4植株REL和H2O2含量顯著高于Ve植株(圖5，B、C)。在高溫處理24 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長，VSlGRAS4和Ve植株的Fv/Fm均下降，且在處理12和24 h時(shí)，VSlGRAS4植株Fv/Fm分別下降為Ve植株的95.27%和46.76%(圖5，D)。高溫處理8 h時(shí)，VSlGRAS4植株SOD和POD活性相對(duì)于Ve植株顯著降低(圖5，E、F)；高溫處理下，VSlGRAS4植株APX活性相對(duì)于Ve植株降低，但差異性不顯著(圖5，G)。這些結(jié)果均表明SlGRAS4提高了番茄耐高溫脅迫能力。

A.內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)；B.編碼蛋白結(jié)構(gòu)域；C.啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件；標(biāo)尺在圖A和B中分別代表mRNA和蛋白長度，在圖C中代表順式元件在啟動(dòng)子區(qū)域位置圖1 SlGRAS4基因特征分析A.Intron and exon structure;B.Coding protein domain;C.Cis-acting elements in the promoter region The ruler represents the length of the mRNA and protein in Fig.A and B,and represents the position of the cis-element in the promoter region in Fig.CFig.1 SlGRAS4 gene characteristic analysis

A.多序列比對(duì)；B.蛋白進(jìn)化樹，標(biāo)尺表示遺傳距離，數(shù)值表示從1 000次重復(fù)計(jì)算得到的 Bootstrap；C.保守基序圖2 SlGRAS4蛋白同源性分析A.Multiple sequence alignment;B.Protein homology tree,the scale represents the genetic distance,the value represents the percentage of Bootstrap obtained from 1 000 repetitions;C.Conserved motif;Fig.2 SlGRAS4 protein homology analysis

2.4 沉默SlGRAS4降低了番茄高溫和ROS信號(hào)應(yīng)答基因表達(dá)水平

為了揭示SlGRAS4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控番茄耐高溫脅迫可能的分子機(jī)制，對(duì)高溫和ROS信號(hào)應(yīng)答基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。正常溫度下，高溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵基因HsfA1a、HsfA1b和Hsp90表達(dá)量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異(圖6，A-C)，高溫處理后表達(dá)量顯著上調(diào)。VSlGRAS4植株中的HsfA1b表達(dá)量在高溫處理8 h時(shí)顯著低于Ve植株(圖6，B)，Hsp90表達(dá)量在高溫處理4 h時(shí)顯著低于Ve植株(圖6，C)，這說明高溫脅迫下SlGRAS4基因沉默影響了正常的高溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。正常溫度下，ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因ZAT10和ZAT12的表達(dá)量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異，在高溫處理4和8 h時(shí)，ZAT10和ZAT12在VSlGRAS4植株中的表達(dá)量均顯著低于Ve植株(圖6，D、E)，這說明高溫脅迫下SlGRAS4基因沉默影響正常的ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ROS清除酶編碼基因(包括CuZnSOD、FeSOD、CAT、APX1和APX2)是ROS信號(hào)的主要應(yīng)答基因，在正常溫度下，這些基因表達(dá)量在VSlGRAS4和Ve植株中無顯著性差異。CuZnSOD、FeSOD、CAT和APX2表達(dá)量于高溫處理8 h內(nèi)，在VSlGRAS4和Ve植株中不斷上升，且在處理8 h時(shí)表現(xiàn)為VSlGRAS4植株顯著低于Ve植株；在高溫處理4 h時(shí)，APX1在VSlGRAS4植株中表達(dá)量顯著低于Ve植株(圖6，F(xiàn)-J)。說明高溫脅迫下沉默SlGRAS4基因可以通過降低ROS清除酶編碼基因的表達(dá)量來降低番茄耐熱性。

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.對(duì)照番茄植株(V-empty)；A.瓊脂糖凝膠電泳鑒定(M.DL2000；1.PCR 擴(kuò)增結(jié)果；2.大腸桿菌菌落PCR結(jié)果)；B.SlGRAS4基因qRT-PCR結(jié)果，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 VSlGRAS4植株的鑒定VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty);A.Agarose gel electrophoresis identification(M.DL2000;1.PCR amplification results;2.E.coli colony PCR results);B.qRT-PCR qualitative analysis of SlGRAS4 gene,different letters are significant at 0.05 levelFig.4 Identification of VSlGRAS4 plants

VSlGRAS4.沉默SlGRAS4基因番茄植株；Ve.對(duì)照番茄植株(V-empty)；星號(hào)表示在Student’s t test檢驗(yàn)中，Ve與VSlGRAS4的差異顯著性，*代表P<0.05，**代表 P <0.01，***代表 P <0.001，下同圖5 SlGRAS4對(duì)番茄耐高溫(40 ℃/40 ℃，晝/夜)脅迫能力的影響VSlGRAS4.SlGRAS4-silencing tomato plants;Ve.Control plants (V-empty)；Asterisks indicate significant differences between VSlGRAS4 and Ve with Student’s t test,* represents P <0.05,** represents P <0.01,and *** represents P <0.001;the same as belowFig.5 Effects of SlGRAS4 silencing on tomato heat tolerance (40 ℃/40 ℃,day/night)

圖6 高溫和ROS信號(hào)應(yīng)答基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression levels of response genes involved in heat and ROS signaling

3 討 論

3.1 SlGRAS4參與番茄對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)

前人研究表明，SlGRAS4和AtSCL14屬于GRAS基因家族中SCL9亞家族分支成員[20]，過表達(dá)AtSCL14通過增強(qiáng)β-CCA介導(dǎo)的保護(hù)性逆行反應(yīng)降低有毒過氧化物和羰基化合物的水平，提高擬南芥對(duì)干旱脅迫耐受性，降低嫩葉組織對(duì)高光脅迫的敏感性[30-31]。序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)SlGRAS4與AtSCL14具有相同保守基序和較近親緣關(guān)系，這表明SlGRAS4可能具有與AtSCL14相似參與調(diào)控干旱和高光脅迫的生物功能。研究表明轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)不同脅迫時(shí)具有顯著的重疊和交叉性[32]。本研究中，在高溫和低溫脅迫以及ABA和SA激素處理下，SlGRAS4同時(shí)被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，而干旱和鹽脅迫處理下，SlGRAS4被顯著誘導(dǎo)表達(dá)則發(fā)生在之后，并且本研究中在SlGRAS4啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到ABA和SA響應(yīng)元件，推測SlGRAS4可能通過ABA和SA依賴型脅迫應(yīng)答途徑交叉響應(yīng)4種逆境脅迫，此外，SlGRAS4可能還通過其他途徑參與番茄對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)。這些結(jié)果均表明SlGRAS4參與番茄對(duì)逆境脅迫響應(yīng)。

3.2 SlGRAS4可以提高番茄耐高溫脅迫能力

Huang等[20]和牛義嶺等[22]通過全基因組分析均在番茄中鑒定出53個(gè)SlGRAS轉(zhuǎn)錄因子，并分析了這些轉(zhuǎn)錄因子的基因與蛋白結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及在番茄不同組織和非生物脅迫處理下的表達(dá)模式。其中，Huang等[20]發(fā)現(xiàn)53個(gè)SlGRAS基因中有30 個(gè)在高溫脅迫下顯著誘導(dǎo)表達(dá)，且SlGRAS4在高溫處理下的表達(dá)量較高，相比對(duì)照上調(diào)了30倍。本實(shí)驗(yàn)室通過轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)SlGRAS4在高溫脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，但SlGRAS成員均未做耐熱功能鑒定。因此，本研究選取對(duì)高溫脅迫較為敏感的SlGRAS4利用VIGS技術(shù)進(jìn)行耐熱功能鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)VSlGRAS4植株相對(duì)于Ve植株在高溫脅迫下更容易萎蔫，F(xiàn)v/Fm以及SOD和POD抗氧化酶活性顯著降低，REL和H2O2含量顯著升高，這說明在高溫脅迫下沉默SlGRAS4使番茄植株細(xì)胞膜氧化損傷加重，光合能力降低，ROS清除酶活性減弱。前人研究表明VaPAT1擬南芥轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下的黃化程度和干旱脅迫下的萎蔫程度均顯著輕于野生型株系[18]。轉(zhuǎn)ZmSCL7煙草在鹽脅迫下與對(duì)照相比Fv/Fm和葉綠素含量上升，丙二醛含量下降[33]。過表達(dá)SlGRAS7番茄株系在干旱和鹽脅迫下的SOD、CAT和APX 活性顯著高于野生型株系[23]。過表達(dá)VaPAT1擬南芥株系在鹽和干旱脅迫下POD活性顯著高于野生型株系[18]。這與本研究結(jié)果一致，說明SlGRAS4在高溫脅迫下通過增強(qiáng)光合和抗氧化能力來提高番茄耐高溫脅迫能力。

3.3 SlGRAS4可以通過調(diào)控高溫和ROS應(yīng)答基因表達(dá)來影響番茄耐熱性

植物在高溫脅迫下會(huì)激發(fā)體內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路，這些信號(hào)應(yīng)答基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控植物對(duì)高溫脅迫耐受性。本研究VSlGRAS4植株中高溫信號(hào)應(yīng)答關(guān)鍵基因HsfA1b以及ROS信號(hào)應(yīng)答基因ZAT10和ZAT12表達(dá)水平均顯著低于Ve植株，表明SlGRAS4轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控高溫和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響番茄耐熱性。ROS清除酶是熱激響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，高溫脅迫下植物通過轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)ROS清除酶編碼基因的表達(dá)水平。研究表明，逆境脅迫下擬南芥中GRAS家族成員DELLAs通過提高ROS去氧化酶編碼基因CuZnSOD和FeSOD的表達(dá)，使ROS處于較低水平，延緩細(xì)胞死亡[34]。過表達(dá)OsGRAS23水稻株系在干旱脅迫下POD和GST表達(dá)量相對(duì)于野生株系顯著上調(diào)[17]。過表達(dá)SlGRAS40番茄株系在干旱和鹽脅迫下ROS清除酶編碼基因APX、CAT、SOD、POD表達(dá)量均顯著高于野生型株系[23]。前人通過ChIP-seq和酵母單雜實(shí)驗(yàn)證明ROS清除酶包括POD、APX和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼基因是番茄SlGRAS4轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，它們的啟動(dòng)子被SlGRAS4高度激活[35]。本研究檢測了ROS清除酶編碼基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)VSlGRAS4植株中CuZnSOD、FeSOD、APX1、APX2、CAT表達(dá)量顯著低于Ve植株，說明SlGRAS4轉(zhuǎn)錄因子可以通過提高ROS清除酶編碼基因的表達(dá)來增強(qiáng)番茄耐熱性。

本研究為了解GRAS類轉(zhuǎn)錄因子特征和功能提供信息，同時(shí)對(duì)研究番茄耐熱遺傳育種有重要的理論意義。目前通過VIGS僅證明了SlGRAS4正向調(diào)控番茄耐高溫脅迫響應(yīng)，然而SlGRAS4是否依賴激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及與高溫和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間的聯(lián)系都不清楚，因此后續(xù)將深入研究SlGRAS4耐高溫脅迫調(diào)控機(jī)制。