南亞楠 李亞東 吳 珺 郝 鈺 楊明銳（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京100029）

流感病毒是一種強傳染性的呼吸道病毒，可導致流行性感冒（簡稱流感），患者出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱、頭疼、乏力等癥狀，嚴重者常發(fā)展為病毒性肺炎，甚至死亡［1］。流感病毒感染可引發(fā)機體“細胞因子風暴”，導致肺部炎癥反應［2］。其中，IL-6在感染早期的固有免疫階段即可生成，是主要的促炎細胞因子，其水平高低與流感后肺炎嚴重程度相關(guān)［3］。干擾素（interferon，IFN）-γ、IL-10及IL-17A主要分別由流感病毒誘導機體Th1、Th2/Treg及Th17細胞分泌，以發(fā)揮不同T細胞亞群的免疫效應，其表達水平與肺部炎癥程度呈正相關(guān)［3-4］。趨化因子CCL25則通過與特異性受體CCR9結(jié)合，介導T淋巴細胞定向遷移及組織浸潤［5］。以上細胞因子的生物學效應最終導致肺部免疫損傷及肺炎發(fā)生發(fā)展。

胃腸型流感還包括腹痛、惡心、嘔吐和腹瀉等類似腸胃炎的并發(fā)癥，兒童感染者尤為嚴重［6］。WANG等［7］在小鼠模型中驗證了流感病毒導致小腸免疫損傷及結(jié)腸縮短的現(xiàn)象，并揭示肺源CD4+T細胞可特異性遷移至腸道，破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)。張淑靜等［8］與王惠嫻等［9］研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后腸道病變可累及小腸及大腸組織。流感病毒感染引發(fā)肺、腸損傷的機制尚未明確，但肺臟與腸道的病理相關(guān)性與中醫(yī)臟腑理論體系中“肺與大腸相表里”內(nèi)容相符，提示流感治療過程中應考慮選用對肺臟、腸道均具有保護作用的藥物。

小檗堿又稱黃連素，是從中草藥黃連等植物中提取的異喹啉類生物堿，具有多種藥理作用，臨床多用于治療細菌性痢疾、急性腸胃炎等消化道感染［10］。研究表明，在小鼠流感病毒性肺炎的體內(nèi)模型中，小檗堿對病毒性肺炎具有較好的治療作用，可有效降低死亡率、延長生命、改善肺組織炎癥病變［11-13］。因此，小檗堿對腸道炎癥和肺部炎癥均有一定治療作用，但其是否對流感病毒感染導致的肺、腸損傷均具有保護作用尚未闡明。本研究構(gòu)建小鼠模型，探討小檗堿對流感病毒感染導致肺、結(jié)腸損傷的保護作用，并從細胞因子和腸道菌群角度初步探討其作用機制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與病毒株 SPF級BALB/c雄性小鼠，體重13～15 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（合格證號：1103242011006477）；H1N1流感病毒A/Puerto Rico/8/34鼠肺適應株（簡稱PR8）為北京中醫(yī)藥大學生命科學學院免疫與微生物學教研室實驗室凍存，采用Reed Muench法計算PR8對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為10-2.68［14］。病毒實驗及相關(guān)操作均在動物實驗安全二級實驗室（BSL-2）進行。

1.1.2 藥物與試劑 小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所；利巴韋林注射液購自河北石家莊石藥集團歐意藥業(yè)；IL-6、IL-17A及IFN-γELISA檢測試劑盒購自BioLegend公司；RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒均購自TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 造模、給藥及取材 BALB/c小鼠隨機分為4組：正常組（N）、病毒模型組（M）、利巴韋林組（陽性對照組，P）及小檗堿組（BER），每組8只。乙醚輕度麻醉下，滴鼻給予25μl 5 LD50流感病毒PR8毒株構(gòu)建感染模型，對照組滴鼻給予等體積生理鹽水。病毒感染2 h后腹腔注射給予小檗堿（5 mg/kg），利巴韋林（100 mg/kg），0.2 ml/(只·d)，其他組注射給予等體積生理鹽水。每天記錄小鼠一般生存狀況、死亡率和體重。感染后第6天，小鼠眼球取血，殺剖小鼠，取肺臟、結(jié)腸組織，稱重，計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率：肺指數(shù)=肺重（g）/體重（g）×100%，肺指數(shù)抑制率=（模型肺指數(shù)均值-治療組肺指數(shù)均值）×模型肺指數(shù)均值×100%。

1.2.2 ELISA檢測血清細胞因子水平 取血后室溫放置2 h，4℃放置2 h至血液凝固，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，棄不溶物，重復離心1次，分離血清后分裝，按ELISA試劑盒說明書檢測細胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平。

1.2.3 小鼠肺臟RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 TRIzol法提取小鼠肺臟細胞總RNA，分析RNA純度及完整性，確定RNA質(zhì)量合格后，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA，采用SYBRGreen RT-qPCR試劑盒檢測細胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25轉(zhuǎn)錄水平，以GAPDH為內(nèi)參，反應體系20μl，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4 糞便腸道菌群16SrRNA測序 病毒感染后第5天，在超凈臺中采集小鼠新鮮糞便于無菌凍存管，每組5個樣本，由奧維森基因科技有限公司采用Illumina MiSeq測序技術(shù)測定16SrRNA V3-4區(qū)序列，并對群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群進行比較分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism Software 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析并作圖，計量資料以±s表示，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-qPCR檢測使用引物Tab.1 Primersused for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對流感病毒感染小鼠一般情況及體重的影響 正常組小鼠皮毛順滑、有光澤，行動和反應敏捷，進食及大便情況正常，體重逐漸增加。模型組小鼠在感染流感病毒4 d后，出現(xiàn)聳毛、蜷縮、毛無光澤，活動減少、食量減少，大便濕度提高，體重逐漸下降（圖1），最終死亡2只。利巴韋林組與小檗堿組小鼠全部存活，皮毛、活動和進食情況比模型組有所改善；利巴韋林組小鼠體重有回升現(xiàn)象，而小檗堿則對小鼠體重下降有一定減緩作用，呈現(xiàn)與利巴韋林相似的治療效果（圖1）。利巴韋林和小檗堿均可改善小鼠大便稀溏情況。

2.2 小檗堿對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響 課題組前期研究已證明小檗堿可有效改善小鼠肺組織炎癥病變，對小鼠流感病毒性肺炎療效較好［11］。為驗證小檗堿對流感病毒性肺炎的治療作用，本研究取小鼠肺臟后觀察其病變情況，稱量肺臟重量后計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率，結(jié)果顯示，正常組小鼠肺臟表面呈淡紅色，無明顯瘀斑、瘀點；模型組小鼠肺臟呈暗紅色，可見大片狀肺實變病灶，由于充血水腫，肺指數(shù)明顯升高；利巴韋林組小鼠肺臟表征與正常組相近，可顯著降低感染小鼠肺指數(shù)（P＜0.000 1），肺指數(shù)抑制率為41.59%；小檗堿組小鼠肺臟雖然可見少量分散點狀肺實變病灶，但整體呈淡紅色，病變明顯輕于模型組，且小檗堿可降低小鼠感染后肺指數(shù)升高，與模型組差異顯著（P＜0.05），肺指數(shù)抑制率為20.34%（圖2）。

2.3 小檗堿對血清細胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平的影響 流感病毒感染6 d后，ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠血清細胞因子IL-6、IL-17A和IFNγ的水平顯著升高，利巴韋林可顯著降低血清細胞因子IL-6（P＜0.000 1）、IL-17A（P＜0.05）和IFN-γ（P＜0.000 1）水平。而小檗堿對流感病毒感染后血清IL-6和IL-17A的抑制作用無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但小檗堿可顯著降低感染小鼠血清IFN-γ水平（P＜0.05，圖3）。

2.4 小檗堿對肺臟細胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25轉(zhuǎn)錄水平的影響 為進一步研究小檗堿對流感病毒感染后肺部的保護作用機制，對各組小鼠肺臟細胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25 mRNA水平進行檢測，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肺部IFN-γ、IL-10和CCL25轉(zhuǎn)錄水平明顯升高；利巴韋林可顯著降低IFN-γ（P＜0.000 1）、IL-10（P＜0.000 1）和CCL25（P＜0.05）mRNA水平；小檗堿也可顯著抑制IFN-γ（P＜0.000 1）、IL-10（P＜0.000 1）及CCL25（P＜0.01）mRNA轉(zhuǎn)錄水平（圖4）。

圖1 小檗堿對PR8病毒感染小鼠體重的影響Fig.1 Effect of berberine on body weight of mice with PR8 infection

圖2 小檗堿對PR8感染小鼠肺指數(shù)的影響Fig.2 Effect of berberine on body weight of mice with PR8 infection

圖3 小檗堿對PR8感染小鼠血清細胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平的影響Fig.3 Effect of berberine on cytokines IL-6，IL-17A and IFN-γlevels in serum of mice with PR8 infection

圖4 小檗堿對PR8感染小鼠肺臟細胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25 mRNA水平的影響Fig.4 Effect of berberine on mRNA levels of cytokines IFN-γ，IL-10 and CCL 25 in lung of mice with PR8 infection

圖5 小檗堿對PR8感染小鼠結(jié)腸長度和重量的影響Fig.5 Effect of berberine on colon length and weight of mice with PR8 infection

圖6 小檗堿對PR8感染小鼠腸道菌群的影響Fig.6 Effect of berberine on gut microbiota in mice with PR8 infection

2.5 小檗堿對流感病毒感染小鼠結(jié)腸長度和重量的影響 為評估小檗堿對流感病毒感染后腸道的保護作用，測量各組小鼠結(jié)腸長度和重量，結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠平均結(jié)腸長度縮短，重量減輕，證實流感病毒H1N1亞型感染對結(jié)腸的損傷作用。利巴韋林可顯著改善小鼠結(jié)腸縮短（P＜0.01）及重量減輕情況（P＜0.05）。小檗堿可維持感染小鼠結(jié)腸長度（P＜0.001）和重量（P＜0.05，圖5）。提示小檗堿對流感病毒感染引起的結(jié)腸損傷具有一定保護作用。

2.6 小檗堿對流感病毒感染小鼠腸道菌群的影響 為探討腸道菌群在小檗堿結(jié)腸保護效應中的作用，對正常組、模型組和小檗堿組小鼠糞便腸道菌群16SrRNA V3-4區(qū)進行測序，結(jié)果顯示，Shan?non多樣性曲線平穩(wěn)，表明樣品中大部分多樣性已被檢測（圖6A）；韋恩圖顯示，15個樣本中共獲得874個有效操作分類單元（OTUs），其中3組共277個，正常組和模型組共307個，模型組和小檗堿組共555個，正常組和小檗堿組共314個（圖6B）；基于未加權(quán)Unifrac距離算法的非度量多維尺度（NMDS）分析顯示，3組樣本存在差異，小檗堿組水平更接近于正常組，說明小檗堿可影響模型組小鼠腸道菌群整體結(jié)構(gòu)趨向于正常組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化（圖6C）。通過線性回歸分析（LDA）和進化分支統(tǒng)計各組有顯著作用的微生物類群和生物標志性差異物種，發(fā)現(xiàn)小檗堿組區(qū)別于其他2組的優(yōu)勢菌群為Ru?minococcaceae（瘤胃菌科，圖6D、E）。

3 討論

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發(fā)，對全國乃至全世界人民健康造成極大危害，導致此次肺炎感染的病原體，新型冠狀病毒2019-nCoV，與SARS病毒、流感病毒均屬于呼吸道病毒，大部分重癥患者會產(chǎn)生以肺炎為主的呼吸系統(tǒng)癥狀。同時，臨床發(fā)現(xiàn)部分新型冠狀病毒肺炎患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉等呼吸道外癥狀，與胃腸型流感患者類似［15-16］。動物實驗研究也證實小鼠流感病毒性肺炎模型中存在特異性腸道病變，累及小腸及大腸組織［7-9］。提示呼吸道感染病理損傷過程與肺、腸相關(guān)。

小檗堿是黃連、黃柏等植物中提取的異喹啉類生物堿，是獲得FDA認證（FDA UNII：0I8Y3P32UF）的補充膳食，具有顯著抗菌作用，廣泛用于腹瀉、痢疾、胃腸炎等消化道疾病治療。近年小檗堿因被發(fā)現(xiàn)具有多種藥理作用，如抗糖尿病、抗癌、抗纖維化、抗氧化和抗炎，逐漸成為研究熱點［17-19］。流感病毒性炎癥治療中，前期發(fā)現(xiàn)小檗堿對流感病毒性肺炎具有有效保護作用［11］。說明小檗堿對消化道及呼吸道炎癥具有一定療效?？紤]到呼吸道病毒感染“肺腸同治”的基本原則和小檗堿的藥理作用，本文研究小檗堿是否可保護流感病毒引發(fā)的肺與結(jié)腸損傷。

首先，證實小檗堿對流感病毒感染小鼠整體水平具有保護作用，避免過度炎癥反應：降低死亡率，維持體重和正常行為；其次，證實小檗堿對肺部的保護作用：減輕肺部病變，抑制感染后肺指數(shù)升高。流感病毒感染后肺炎的重要表征為細胞因子過度表達而出現(xiàn)“細胞因子風暴”，促炎與抗炎細胞因子相互作用導致肺組織水腫、肺毛細血管滲漏及炎癥細胞滲出，加速肺組織損傷［3］。課題組前期已發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過抑制細胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM）-1、血管內(nèi)皮黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）-1表達及減少腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、單核細胞趨化蛋白（monocyte chemotactic pro?tein，MCP）-1、IL-1β和IL-18產(chǎn)生治療流感病毒性肺炎［12，20］。

為進一步研究小檗堿的作用機制，課題組選取其他細胞因子作為檢測對象，IL-6和IFN-γ是病毒感染后固有免疫階段大量釋放的細胞因子，均為體內(nèi)主要的促炎細胞因子，其水平與流感后肺炎嚴重程度呈正相關(guān)［2-4］。而在適應性免疫應答階段，T淋巴細胞在趨化因子CCL25作用下，向肺部定向遷移并發(fā)生組織浸潤［5，7］，而后不同CD4+T細胞亞群分泌不同細胞因子發(fā)揮效應，IFN-γ是Th1細胞最重要的細胞因子，可激活巨噬細胞、促進病毒清除，與病毒感染后炎癥反應和肺損傷有關(guān)。IL-10可由Th2和Treg產(chǎn)生，Th2通過IL-10促進體液免疫應答，而Treg通過分泌IL-10起抑制炎癥的負調(diào)控作用。IL-17A主要由Th17細胞產(chǎn)生，為多效性細胞因子，可作用于多種細胞以促進炎癥分子表達［2-4］。本研究檢測到流感病毒感染后小鼠血清IL-6，IL-17A及IFN-γ水平與肺臟IFN-γ、CCL25及IL-10轉(zhuǎn)錄水平均急劇升高，而小檗堿對以上細胞因子升高均具有抑制作用，尤其是對IFN-γ、CCL25及IL-10的抑制效果尤其顯著，可避免病毒感染后失控的“細胞因子風暴”損傷。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對流感病毒感染導致的結(jié)腸損傷也具有一定保護作用：改善大便稀溏情況、維持結(jié)腸長度及重量。課題組最初從小檗堿通過抑制炎癥細胞因子保護結(jié)腸的角度進行研究，檢測各組小鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平，未見顯著差異。WANG等［7］認為流感病毒感染激活的肺臟CD4+CCR9+T細胞在CCL25作用下向腸道遷移，可能通過分泌炎癥細胞因子IFN-γ改變腸道菌群組成，促進Th17細胞及IL-17產(chǎn)生，導致腸道炎癥損傷。本研究從腸道菌群角度分析，發(fā)現(xiàn)小檗堿對腸道菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群具有調(diào)節(jié)作用。菌群豐富及更多的瘤胃菌科細菌是有效治療癌癥的腸道菌群特征［21］；臨床案例也證實，提高腸道菌群多樣性及益生菌數(shù)量可有效治療流感病毒感染［22］；據(jù)此，課題組推測小檗堿可能通過抑制T細胞過度激活與遷移，同時調(diào)節(jié)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌種發(fā)揮肺、結(jié)腸保護作用。

治療呼吸道病毒感染不僅要針對病毒，更重要的是對病毒感染后的機體進行有效的整體調(diào)節(jié)。本研究證實小檗堿對流感病毒感染導致的肺部、結(jié)腸損傷均有一定保護作用，并發(fā)現(xiàn)小檗堿可顯著抑制IFN-γ、IL-10和CCL25產(chǎn)生，同時調(diào)節(jié)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌種，保持病毒感染過程中免疫細胞激活及功能平衡，避免“細胞因子風暴”引發(fā)的過度炎癥反應，發(fā)揮肺、結(jié)腸保護作用。本研究為小檗堿的臨床應用提供了實驗證據(jù)，同時提倡流感病毒、新型冠狀病毒等呼吸道病毒感染治療過程中應廣泛采用肺腸同治的方法。