楊 旎,陳 飛,孔令華,霍 霄,沈 鏗

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100730)

宮頸癌發(fā)病率居全球女性癌癥發(fā)病率第二位[1],中國(guó)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[2]。近年來(lái),世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)將宮頸癌預(yù)防作為優(yōu)先事項(xiàng)[3],其病死率明顯下降,但資源匱乏地區(qū)由于缺乏合適的篩查計(jì)劃,仍然面臨極大的負(fù)擔(dān)。因此,HPV的免疫,篩查和治療宮頸癌仍至關(guān)重要[4]。目前臨床使用的篩查手段并不完美,高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,hrHPV)檢測(cè)誤診率高,許多婦女接受了不必要的檢查與治療;細(xì)胞學(xué)篩查準(zhǔn)確性低、結(jié)果可重復(fù)性差、醫(yī)生工作負(fù)荷過(guò)重。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與腫瘤抑制基因p16和增殖細(xì)胞核抗原Ki-67有關(guān)[5]。Schmidt等[6]發(fā)現(xiàn),若在一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)到p16和Ki-67共表達(dá),則高度提示有宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的存在,是近年來(lái)一種較新的宮頸病變檢測(cè)手段。宮頸癌或癌前病變的細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變通常較晚,在不依賴于細(xì)胞形態(tài),結(jié)合細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染檢測(cè),可提高宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)2+的檢出率,減少創(chuàng)傷性檢查。本文比較了細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染檢測(cè)和hrHPV檢測(cè)對(duì)ASCUS患者的分流作用與診斷效能,判斷p16/Ki-67雙染作為生物標(biāo)記物在病理診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例與標(biāo)本 收集2019年4月1日到2019年5月30日在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收治的52例細(xì)胞學(xué)診斷為無(wú)明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undermined significance,ASCUS),同時(shí)行hrHPV檢測(cè),并有宮頸組織病理學(xué)檢查結(jié)果的患者信息,將其剩余宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測(cè)。收集2017年3月1日至2019年3月1日在北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行陰道鏡、錐切或全子宮切除的153例宮頸組織學(xué)標(biāo)本,進(jìn)行p16/Ki-67組織學(xué)雙染檢測(cè),由2名病理學(xué)家進(jìn)行判讀及評(píng)分。從病歷系統(tǒng)獲取患者病史及隨診信息。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡大于20歲;有性生活史,未妊娠;無(wú)子宮頸切除術(shù)史;細(xì)胞學(xué)雙染組患者經(jīng)液基細(xì)胞學(xué)檢查(liquid-based cytology test,LCT)確診為ASCUS,遵循TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠期或哺乳期婦女;參與其他臨床研究者。本研究已獲得倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞學(xué)雙染:宮頸細(xì)胞學(xué)采用Thinprep(Hologic公司,Massachusetts,USA)液基薄片法,hrHPV檢測(cè)采用Cobas4800檢測(cè)系統(tǒng)(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA)。將收集的宮頸脫落細(xì)胞剩余標(biāo)本在BD Sure Path載玻片上制備一張薄片,采用全自動(dòng)免疫組化分析儀(型號(hào)為Benchmark GX)進(jìn)行染色(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA),試劑盒為Roche診斷產(chǎn)品公司的配套試劑CINtec PLUS。組織學(xué)雙染:將組織蠟塊制片,采用全自動(dòng)免疫組化分析儀進(jìn)行染色(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA),試劑盒為Roche診斷產(chǎn)品公司的配套試劑p16/Ki-67組織學(xué)雙染試劑。整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞學(xué)雙染:p16定位于胞質(zhì),顯棕色;Ki-67定位于胞核,顯紅色。當(dāng)滿足1個(gè)細(xì)胞質(zhì)顯棕色(p16),同時(shí)胞核顯紅色(Ki-67),則結(jié)果為雙染陽(yáng)性,無(wú)需考慮細(xì)胞形態(tài),單獨(dú)顯色或不顯色為陰性[8]。細(xì)胞學(xué)檢查采取巴氏染色法,遵循TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。組織學(xué)雙染:使用2019美國(guó)陰道鏡檢查與宮頸病理學(xué)會(huì)(ASCCP)宮頸病理指南為診斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合相應(yīng)的HE染色結(jié)果,由2名病理醫(yī)生在不了解患者病歷信息情況下進(jìn)行閱片,根據(jù)表1的評(píng)分系統(tǒng)[9],將組織學(xué)雙染片進(jìn)行評(píng)分。

表1 組織學(xué)雙染評(píng)分系統(tǒng)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料比較采用方差分析。計(jì)算p16/Ki-67雙染檢測(cè)及hrHPV檢測(cè)方法的靈敏度、特異度、總符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及Kappa系數(shù)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞學(xué)雙染 根據(jù)《WHO女性生殖器官腫瘤學(xué)分類(第4版)解讀》[10],CIN被分為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia,HSIL)?！吨袊?guó)子宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問(wèn)題專家共識(shí)(二)》[11]指出,CIN2中的p16/Ki-67雙染陰性的患者仍歸為L(zhǎng)SIL。為與臨床相統(tǒng)一,本部分仍把HSIL分為CIN2和CIN3,進(jìn)一步觀察p16/Ki-67雙染與hrHPV檢測(cè)對(duì)ASCUS患者的診斷效能。52例細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS的患者,其中組織病理金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果正?；颊?2例,CIN1患者9例,CIN2患者3例,CIN3患者5例,宮頸癌患者3例。不同病變程度患者h(yuǎn)rHPV和p16/KI-67雙染陽(yáng)性率的比較,見(jiàn)表2。p16/Ki-67雙染的陽(yáng)性率與病變程度大致呈正比,特別是在正常和LSIL患者中,p16/Ki-67雙染比hrHPV檢測(cè)符合度更高(P=0.6963)。

表2 不同病變程度hrHPV、p16/Ki-67雙染陽(yáng)性率

若以hrHPV陽(yáng)性或p16/Ki-67雙染陽(yáng)性作為ASCUS患者的陰道鏡分流標(biāo)準(zhǔn),兩者分別會(huì)使42例(80.8%),27例(51.9%)患者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查,p16/Ki-67雙染可減少28.9%的陰道鏡分流。分別計(jì)算hrHPV和p16/Ki-67雙染在檢出CIN2+的診斷效能,見(jiàn)表3。兩者的靈敏度均為90.91%,但p16/Ki-67雙染檢出CIN2+的特異度、總體符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa系數(shù)均優(yōu)于hrHPV檢測(cè)。

表3 CIN2+患者h(yuǎn)rHPV,p16/Ki-67雙染診斷效能的比較

2.2 組織學(xué)雙染 153例患者中,病理診斷結(jié)果正?；颊?例,LSIL患者46例,HSIL患者59例,宮頸微小浸潤(rùn)癌(microinvasive carcinoma,MIC)患者38例,宮頸癌患者2例。p16/Ki-67雙染的陽(yáng)性率與病變程度大致成正比,見(jiàn)表4。

表4 組織學(xué)雙染評(píng)分結(jié)果

3 討 論

近年來(lái)hrHPV檢測(cè)在宮頸癌篩查中所占的角色越來(lái)越重要,已被一些國(guó)家作為初篩手段納入宮頸癌篩查體系,但超過(guò)90%的HPV感染可自然消退[12]。同時(shí),病理細(xì)胞學(xué)醫(yī)生缺乏,診斷結(jié)果可重復(fù)性差,制片質(zhì)控參差不齊,也限制了其發(fā)展。p16/Ki-67雙染檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、系統(tǒng),無(wú)內(nèi)源性生物素干擾,易于觀察,其原理依據(jù)為p16蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,其過(guò)表達(dá)提示細(xì)胞處于細(xì)胞周期的阻滯期。Ki-67反映細(xì)胞周期進(jìn)展及增殖活躍,其陽(yáng)性提示宮頸細(xì)胞處于細(xì)胞周期的增殖期。正常生理狀態(tài)下,p16和Ki-67的表達(dá)相互制約,達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞中,二者共表達(dá)提示細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)[13]。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證p16/Ki-67雙染有助于識(shí)別病變細(xì)胞。

hrHPV陽(yáng)性是臨床上常見(jiàn)的篩查異常結(jié)果,結(jié)合細(xì)胞學(xué)結(jié)果許多患者的處理流程是轉(zhuǎn)診陰道鏡。Liu等[14]研究表明,平均隨訪2年,僅有2.4%細(xì)胞學(xué)陰性且 hrHPV陽(yáng)性患者進(jìn)展為 CIN2。Yang等[15]研究細(xì)胞學(xué)陰性且hrHPV陽(yáng)性患者3年CIN3+累積風(fēng)險(xiǎn)為6.8%,由此可見(jiàn),以hrHPV陽(yáng)性作為宮頸癌篩查方法或分流手段會(huì)造成過(guò)高的陰道鏡轉(zhuǎn)診率,造成了大量的醫(yī)療資源浪費(fèi)。本研究結(jié)果顯示,p16/Ki-67雙染的陽(yáng)性率與病變程度大致呈正比,特別是在CIN2-的患者中,比hrHPV檢測(cè)結(jié)果符合度更高,降低假陽(yáng)性率,使患者避免不必要的有創(chuàng)檢查或治療。本研究結(jié)果顯示,hrHPV和p16/Ki-67雙染對(duì)檢出CIN2+的敏感性相同,但p16/Ki-67雙染誤診率低,與病理金標(biāo)準(zhǔn)符合率更高,結(jié)果與Peeters等[16]薈萃分析結(jié)果相符;并且,p16/Ki-67雙染讀片簡(jiǎn)單易行,對(duì)單純細(xì)胞學(xué)讀片也有輔助作用,對(duì)于醫(yī)療資源不發(fā)達(dá)、設(shè)施不完善的貧困偏遠(yuǎn)地區(qū)的宮頸癌篩查推進(jìn)有十分重要的意義。

本研究比較了不同組織病變程度下組織學(xué)p16/Ki-67雙染結(jié)果,并進(jìn)行了評(píng)分,以探討p16/Ki-67雙染在判斷宮頸癌前病變患者轉(zhuǎn)歸方面的作用,以及p16/Ki-67雙染是否可作為宮頸病變病理診斷輔助生物標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn),p16/Ki-67雙染陰性患者的病理結(jié)果優(yōu)于雙染陽(yáng)性的患者。本研究顯示,p16/Ki-67雙染與病理金標(biāo)準(zhǔn)有很好的符合度,其隨著病變程度加重雙染陽(yáng)性率升高。因此,對(duì)于p16/Ki-67雙染陽(yáng)性的患者,臨床上應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注,注意運(yùn)用多學(xué)科進(jìn)行排查,密切隨訪,及時(shí)預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)HSIL等病變,做到早診斷、早治療。

p16/Ki-67雙染全部染色過(guò)程在全自動(dòng)免疫組化儀內(nèi)進(jìn)行,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,無(wú)需占用醫(yī)生工作時(shí)間,可提高工作效率,縮短病理報(bào)告發(fā)放周期。雖然p16/Ki-67雙染有著較好的病變符合率,提高了CIN2+病變的檢出率,但仍存在一定的漏診和誤診,這可能由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中制片質(zhì)量與方法不穩(wěn)定,使雙染片中存在細(xì)胞稀疏或成團(tuán),從而影響判讀結(jié)果;同時(shí)因?yàn)殚喥?jīng)驗(yàn)不足,可能導(dǎo)致誤判。為提高制片質(zhì)量,可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn):(1)制片前去除標(biāo)本中的血液黏液,使背景更清晰。(2)宮頸細(xì)胞存放在液基細(xì)胞保存液中不宜超過(guò)6周,以防止抗原丟失。(3)雙染實(shí)驗(yàn)應(yīng)在干燥液基細(xì)胞學(xué)玻片制備好后3天內(nèi)進(jìn)行。(4)注意試劑保質(zhì)期極儀器定期維護(hù)。

綜上所述,p16/Ki-67雙染可提高CIN2+的診斷效能,其作為一種宮頸篩查分流手段,可有效減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率,同時(shí)具有簡(jiǎn)便易重復(fù)、客觀高效等優(yōu)點(diǎn)。p16/Ki-67雙染作為一種生物學(xué)標(biāo)記物,與組織病理學(xué)有很好的符合度,可輔助病理診斷以及對(duì)臨床轉(zhuǎn)歸的判斷。