聶 辰 高 磊 王俊懿 李月廷

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院外科，北京 100039；2.北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司，北京 100085；3.北京市哲大生物科技有限公司，北京 100086

Lynch 綜合征是一種錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因發(fā)生種系突變導(dǎo)致的綜合征。1966 年美國(guó)學(xué)者Lynch[1]最早描述本病的特征，即結(jié)直腸癌和其他結(jié)直腸外腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。自1990 年起，國(guó)內(nèi)外發(fā)布了多種針對(duì)本病的臨床篩選標(biāo)準(zhǔn)[2-6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Lynch 綜合征檢測(cè)和診斷的實(shí)驗(yàn)室方法日趨成熟，已形成以MMR 基因測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)的篩查手段。在治療方面，仍以手術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)治療方法[6-7]。術(shù)后應(yīng)用以氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案，能顯著改善MMR 無(wú)突變結(jié)腸癌患者的無(wú)病生存期，與這類結(jié)直腸癌比較，化療對(duì)于Lynch 綜合征結(jié)直腸癌有其特殊性，有文獻(xiàn)報(bào)道氟尿嘧啶類藥物在Lynch 綜合征結(jié)直腸癌術(shù)后化療中效果不佳[8-9]。氟尿嘧啶是結(jié)直腸癌常用化療藥物，被廣泛應(yīng)用于各種一線化療方案。與其療效相關(guān)的熱點(diǎn)研究基因主要是胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）基因。胸苷酸合成酶由TYMS 基因編碼，是腫瘤生長(zhǎng)的重要因子，是5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）類藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶[10-11]。本研究對(duì)來(lái)自北京地區(qū)4 所醫(yī)院的102 例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織行免疫組化染色及MRR 基因測(cè)序，篩選出Lynch 綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌患者，對(duì)這些患者的TYMS 基因測(cè)序，研究TYMS 基因的多態(tài)性，并通過(guò)文獻(xiàn)分析TYMS 基因多態(tài)性與Lynch 綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌患者化療效果的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

102 例結(jié)直腸癌組織全部來(lái)自2015 年4 月—2016 年12 月于北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）、中日友好醫(yī)院、北京市中醫(yī)醫(yī)院和北京大學(xué)人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的患者，男61 例，女41 例；發(fā)病年齡26～87 歲，平均（64.20±12.76）歲。所有納入研究的患者均經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診為結(jié)腸癌或直腸癌。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)

1.2.1.1 試劑與儀器 MLH1 和MSH2 一抗來(lái)自Novocastra 公司，MSH6 和PMS2 一抗來(lái)自Epitomics 公司。光學(xué)顯微鏡來(lái)自?shī)W林巴斯公司（型號(hào)：CX31）。

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 蛋白的表達(dá)。操作步驟如下：將腫瘤組織蠟塊連續(xù)切片，厚度約4 μm，放入70℃烤箱烤片1 h。二甲苯梯度脫蠟3 次各10 min；梯度水化：無(wú)水乙醇水化3 次各5 min；95%乙醇水化2 次各2 min；80%乙醇水化2 min。自來(lái)水、蒸餾水分別沖洗20 s。放入3%過(guò)氧化氫溶液10 min。自來(lái)水、蒸餾水分別沖洗20 s，放入PBS 緩沖液中。組織修復(fù)：使用pH 8.0 的EDTA 緩沖液作為修復(fù)液。待高壓鍋內(nèi)修復(fù)液沸騰后，放入切片，蓋緊鍋蓋，待閥門噴氣開始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間為2 min。待高壓鍋停止噴氣后用流水沖洗高壓鍋降溫約10 min。切片取出后放入PBS緩沖液中充分洗滌3 次，每次3 min。取出切片，擦干組織周圍液體后滴加一抗。滴加一抗后放入專用孵育盒內(nèi)室溫孵育2 h，或4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。切片放入PBS緩沖液中清洗3 次，每次3 min。滴加二抗（基本要求同一抗），室溫孵育20 min。切片放入PBS 緩沖液內(nèi)洗滌3 次，每次3 min。進(jìn)行DAB 顯色，顯色時(shí)需鏡下控制顯色強(qiáng)度，待強(qiáng)度恰當(dāng)時(shí)及時(shí)終止。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30 s。分化、返藍(lán)。梯度酒精脫水后，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.2.1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參考Friedrichs 等[12]免疫組化半定量積分法作為判定標(biāo)準(zhǔn)，觀察染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比。在40 倍鏡下連續(xù)觀察10 個(gè)視野，染色強(qiáng)度計(jì)分（染色需與背景著色比較）：0 分無(wú)色，1 分淺黃色，2 分棕黃色，3 分棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比計(jì)分：陰性為0 分，≤10%為1 分，>10%～50%為2 分，>50%～80%為3 分，＞80%為4 分。將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比記分相乘，乘積≥2 分表示蛋白表達(dá)正常（陽(yáng)性），乘積=1 分表示蛋白低表達(dá)（弱陽(yáng)性）、乘積=0 分表示蛋白表達(dá)缺失或蛋白表達(dá)異常（陰性）。在統(tǒng)計(jì)時(shí)，蛋白低表達(dá)和蛋白表達(dá)缺失均視為陰性。陽(yáng)性對(duì)照為內(nèi)部核染色陽(yáng)性的良性腸上皮和/或淋巴細(xì)胞。

1.2.2 基因檢測(cè)

1.2.2.1 試劑與儀器 組織提取DNA 試劑盒采用QIAgen FFPE DNA kit，PTC-200 PCR 儀來(lái)自BIO-RAD公司，DYY-8C 電泳儀來(lái)自北京六一儀器廠，UV-IV紫外分析儀來(lái)自北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所，Ex Taq DNA 聚合酶來(lái)自Takara 公司，5417R 低溫臺(tái)式離心機(jī)來(lái)自Eppendorf 公司，ABI 3730XL 型DNA 測(cè)序儀來(lái)自Applied Biosystems 公司。

1.2.2.2 DNA 提取 采用QIAgen 公司的組織提取DNA 試劑盒提取DNA。

1.2.2.3 PCR 針對(duì)MLH1 基因第1-19 號(hào)外顯子，MLH2基因第1～16 號(hào)外顯子，MSH6 基因第1～10 號(hào)外顯子，PMS2 基因第1～15 號(hào)外顯子，以及TYMS 基因第1 號(hào)外顯子設(shè)計(jì)合成引物，使用軟件Primer Premier 3.0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物。TYMS 基因第1 號(hào)外顯子上游引物：5’-TGTGCTGCTGGCTTAGAGAA-3’，下游引物：5’-AGGTTAGGACTAAACGGGGT-3’。反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性5 min，96℃變性20 s，52～62℃退火2 min，72℃延伸30 s，共10 個(gè)循環(huán)，然后96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸2 min，4℃保存。

1.2.2.4 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè) 稱取瓊脂糖粉0.6 g，加入30 mL 0.5×TBE，加熱融化，配成2%的瓊脂糖凝膠。加入1.5 μL 溴化乙錠（10 mg/mL）至溴化乙錠終濃度為0.5 μg/mL，混合均勻后冷卻至55℃，倒入膠板，插入加樣梳。充分冷卻后，拔除加樣梳，置入電泳槽，加入適量0.5×TBE，使液面超過(guò)凝膠1 mm。取PCR產(chǎn)物5 μL，加入Loading Buffer 1 μL，加入凝膠加樣孔中。恒壓75 V 電泳（根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度計(jì)算，3～5 V/cm），當(dāng)指示劑遷移足夠遠(yuǎn)距離時(shí)停止電泳。將膠板移至紫外燈下觀察。

圖1 TYMS 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.2.2.5 PCR 產(chǎn)物純化 按照Millipore 公司96 孔純化板流程操作：向96 孔純化板孔中加入100 μL 雙蒸水，取出PCR 產(chǎn)物至96 孔純化板中室溫靜置10 min，真空抽濾泵抽10 min 至抽干，向96 孔純化板中加入40 μL雙蒸水，室溫溶解10 min，取出對(duì)應(yīng)孔中的純化產(chǎn)物至另一個(gè)96 孔板中。

1.2.2.6 PCR 產(chǎn)物測(cè)序 測(cè)序反應(yīng)體系為：2 μL 混合物（Bigdye3.1、5×測(cè)序buffer、水），2 μL PCR 純化產(chǎn)物，1 μL 引物（5 mmol/L）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性15 s，50℃退火5 s，60℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)，終止反應(yīng)。在DNA 測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Lynch 綜合征患者的篩查

經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)篩查，在102 例標(biāo)本中至少有1 個(gè)MMR 基因表達(dá)為陰性，共30 例。對(duì)這30 例標(biāo)本MMR 基因外顯子擴(kuò)增測(cè)序，其中至少有1 個(gè)MMR 基因發(fā)生突變，共10 例。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，共10 例確定為L(zhǎng)ynch 綜合征患者。見(jiàn)表1。

表1 MMR 基因突變位點(diǎn)

2.2 TYMS 基因多態(tài)性

對(duì)上述10 例Lynch 綜合征患者的結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行TYMS 基因多態(tài)性的篩查，存在2R/2R、2R/3RG、3RC/3RC、3RC/3RG、3RG/3RG 5 種基因型。3RC/3RG、2R/3RG、3RG/3RG 為高表達(dá)，男4 例、女2 例；3RC/3RC、2R/2R 為低表達(dá)，男1 例、女3 例。見(jiàn)表2。

表2 TYMS 基因多態(tài)性

3 討論

中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2018 年我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中均位居第2 位，死亡率居第5 位[13]，35%結(jié)直腸癌是遺傳性的[14]。Lynch 綜合征作為最常見(jiàn)的一種遺傳性結(jié)直腸癌，占每年新發(fā)病例的2%～5%[15]。國(guó)內(nèi)學(xué)者指出，我國(guó)結(jié)腸癌患者中有5.6%～6.4%為L(zhǎng)ynch 綜合征[16-17]。本研究結(jié)果顯示，在102 例結(jié)直腸癌患者中，有10 例表現(xiàn)出MMR 基因突變?nèi)笔?，可診斷為L(zhǎng)ynch 綜合征，發(fā)病率高達(dá)9.8%，高于世界每年新發(fā)病例平均水平。

自20 世紀(jì)50 年代面世以來(lái)，氟尿嘧啶類藥物已成為結(jié)直腸癌輔助治療不可或缺的部分。然而，氟尿嘧啶類藥物的反應(yīng)率低、毒副作用高。即使采用不同劑量及用藥方案，5-FU 和亞葉酸治療晚期結(jié)直腸癌的反應(yīng)率也僅有21%[18]。NCCN 結(jié)直腸癌指南指出[8]，表現(xiàn)為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的Ⅱ期結(jié)直腸癌患者無(wú)法從5-FU 輔助化療中獲益。因此，預(yù)測(cè)氟尿嘧啶對(duì)患者的療效，有利于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療，更好地服務(wù)患者。

TYMS 基因的表達(dá)產(chǎn)物胸苷酸合成酶是腫瘤細(xì)胞DNA 合成的重要因子，5-FU 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟脫氧尿苷一磷酸，與脫氧尿苷一磷酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胸苷酸合成酶，阻斷腫瘤細(xì)胞DNA 合成，從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用[19]。因此，TYMS 的表達(dá)水平可直接影響氟尿嘧啶類藥物的抗腫瘤效果，以5-FU 為基礎(chǔ)的化療效果不佳與TYMS mRNA 水平高有關(guān)[20-21]。近年研究顯示[22]，從多態(tài)性及表達(dá)水平來(lái)看，TYMS 基因是氟尿嘧啶類藥物療效的預(yù)測(cè)因子。TYMS 基因有3 種多態(tài)性可顯著影響該基因表達(dá)，即：數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VNTR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和缺失多態(tài)性。

TYMS 基因5’非翻譯區(qū)存在28 bp 的串聯(lián)重復(fù)序列，串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目不同，分兩次重復(fù)（2R）和三次重復(fù)（3R），主要有2R/2R、2R/3R 和3R/3R 3 種常見(jiàn)類型。串聯(lián)重復(fù)序列包含上游刺激因子-1 的增強(qiáng)盒子（E-box），促進(jìn)TYMS 基因轉(zhuǎn)錄，因此串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目越多，TYMS 基因轉(zhuǎn)錄越活躍[22]。國(guó)內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)TYMS 蛋白表達(dá)上調(diào)與3R 等位基因有關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)TYMS 基因多態(tài)性表現(xiàn)為3R/3R 患者占70%，2R/2R、2R/3R 患者合計(jì)占30%，提示氟尿嘧啶類藥物對(duì)多數(shù)Lynch 綜合征結(jié)直腸癌可能療效不佳。

TYMS 基因多態(tài)性可進(jìn)一步表現(xiàn)為3R 等位基因的第二次重復(fù)中的第12 位堿基為G/C（3RC/3RG）。這種SNP 能夠改變E-box 的序列，在決定TYMS 基因表達(dá)方面比VNTR 更重要。與3RG 等位基因比較，3RC 等位基因能降低轉(zhuǎn)錄活躍程度，與2R 等位基因類似[24]。因此，結(jié)合VNTR 和SNP 兩種TYMS 基因多態(tài)性，可將本研究中的Lynch 綜合征患者分為兩類：2R/2R 和3RC/3RC 為TYMS 低表達(dá)組（占40%），即氟尿嘧啶類藥物對(duì)該組患者療效較好；2R/3RG、3RC/3RG 和3RG/3RG 為TYMS 高表達(dá)組（占60%），即氟尿嘧啶類藥物對(duì)該組患者療效不佳。

馬來(lái)西亞學(xué)者研究顯示，在結(jié)直腸癌患者中，TYMS 基因的表達(dá)存在性別差異，TYMS 高表達(dá)的人群中，76.2%為男性，女性僅占23.8%[25]。這一分歧可能與人種、納入觀察的結(jié)直腸癌患者群體等因素有關(guān)，尚待進(jìn)一步大樣本試驗(yàn)研究。國(guó)內(nèi)學(xué)者胡德升等[26]對(duì)120 例結(jié)直腸癌患者研究后提出類似觀點(diǎn)，TYMS 表達(dá)與患者的性別、年齡、組織學(xué)分型、腫瘤部位、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，而與患者TNM 分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05）。

本研究對(duì)TYMS 基因進(jìn)行序列分析，分析其基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)多中心Lynch 綜合征結(jié)直腸癌患者TYMS 基因多態(tài)性大多與該基因高度表達(dá)相關(guān)，氟尿嘧啶類藥物對(duì)這類患者療效不佳。但仍有少量患者TYMS 基因多態(tài)性決定該基因低度表達(dá)，應(yīng)用以氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)的化療方案可收到良好的效果。因此，在臨床上可對(duì)Lynch 綜合征結(jié)直腸癌患者進(jìn)行TYMS 基因序列分析，采用個(gè)體化用藥方案，提高療效。