鄧夢(mèng)琪 張艷芹 常翔宇 吳 迪 徐春玉 苗勁蔚

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006

microRNA（miRNA）是一類特殊的非編碼RNA，長約21～23 個(gè)核苷酸，通過與靶基因核糖核酸（mRNA）的3’-非編碼區(qū)（3’-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平修飾靶基因，從而調(diào)控基因表達(dá)[1-3]。近年來，miR-29 家族在多種腫瘤中起著重要的作用，miR-29c-3p 可以調(diào)控多種致癌過程，包括表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、代謝、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、纖維化、血管生成和免疫調(diào)節(jié)[4-5]。目前對(duì)于同家族的Hsa-miR-29c-5p的研究處于初級(jí)階段，僅在食管癌[6]、膽囊癌[7]等中探討其作為抑癌基因并影響腫瘤發(fā)展進(jìn)程的可能性。卵巢透明細(xì)胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）屬于卵巢上皮惡性腫瘤，其特性是起病隱匿、進(jìn)展迅速、復(fù)發(fā)率高[8-11]。此外，透明細(xì)胞癌在早期表現(xiàn)為頻繁轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)和實(shí)質(zhì)器官中，導(dǎo)致高度復(fù)發(fā)[12-14]。但在OCCC 中，Hsa-miR-29c-5p 相關(guān)報(bào)道較為罕見。基于此，本研究通過生物信息學(xué)方法分析Hsa-miR-29c-5p 在OCCC 細(xì)胞株中的表達(dá)情況及對(duì)細(xì)胞增殖、遷移活性的影響，旨在為OCCC 的治療及預(yù)后提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和設(shè)備

1.1.1 細(xì)胞株 人正常卵巢上皮細(xì)胞株（IOSE80）購自上?；鄯f生物科技有限公司，人OCCC 細(xì)胞株（ES-2）購自武漢普諾賽公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料RPMI-1 640 培養(yǎng)基（31800）、McCoy-s-5-A 培養(yǎng)基（M9420）、1XPBS 溶液（P1020）、RIPA 裂解液（R0010）、CCK-8 試劑盒（CA1210）均購自索萊寶生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（CW0627S）購自康為世紀(jì)；qRT-PCR 引物（MQP-0101）、qRTPCR 試劑盒（C10511-1）、Hsa-miR-29c-5p mimics（miR1190416032503）及miR-NC（miR1N0000001-1-5）均購自廣州銳博有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及Hsa-miR-29c 轉(zhuǎn)染將IOSE80置入RPMI-1 640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，ES-2置入含10%胎牛血清的McCoy-s-5-A 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)，每48～72 小時(shí)更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。Hsa-miR-29c 轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長期的ES-2 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔約5×105個(gè)，于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞匯合度為30%～50%時(shí)，轉(zhuǎn)染組加入100 nmol的Hsa-miR-29c-5p mimics，對(duì)照組加入100 nmol 的miR-NC。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 取5×106～10×106個(gè)ES-2細(xì)胞加入1 mL 的TRIzol 試劑進(jìn)行裂解，反復(fù)吹打，10 min 后再加入2000 μL 氯仿，手動(dòng)振蕩15 s后在室溫下靜置10 min，于4°C，12 000 g 離心20 min 后取上層清液，加入等體積異丙醇，均勻混合后同等條件下再次離心，收集下層沉淀，按照每1 mL TRIzol 加入1 mL 75%乙醇洗滌，再于同等條件下離心1 min 后晾干，再加入無RNA 酶水溶解沉淀。然后用酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 濃度，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（銳博）的說明書將總RNA 合成cDNA，于-80°C 保存。循環(huán)參數(shù)如下：①預(yù)變性95°C 持續(xù)30 s；②95°C 持續(xù)5 s，然后60°C 持續(xù)30 s，循環(huán)40 次；③95°C 持續(xù)15 s，然后60°C 持續(xù)30 s，再95°C 持續(xù)15 s。再參照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)，測(cè)定Hsa-miR-29c-5p及內(nèi)參基因U6 的miRNA 表達(dá)情況。Hsa-miR-29c-5p 上游引物為5’-TAGCAC-CATTTGAAAT-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCC-GAGGT-3’；內(nèi)參基因U6 上游引物為5’-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。最終計(jì)算ΔΔ 循環(huán)數(shù)（Ct）=（Ct轉(zhuǎn)染組目的基因-Ct內(nèi)參基因）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.2.3 CCK-8 法 取對(duì)數(shù)生長期ES-2 分別接種于96 板孔中（細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL），水套式37°C 恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染組加入含100 nmol Hsa-miR-29c-5p mimics 的McCoy-s-5-A 培養(yǎng)基，對(duì)照組加入100 nmol miR-NC的McCoy-s-5-A 培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h分別向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，用Cytation 3 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）檢測(cè)450 mm 波長處每孔的吸光度值。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6 孔板中每孔加入約5×105個(gè)ES-2 細(xì)胞，分為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組。24 h 后用移液槍槍頭垂直于板面做出劃痕，并用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞3 次，去除劃下的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染組加入含100 nmol HsamiR-29c-5p mimics 的無血清培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含100 nmol miR-NC 的無血清培養(yǎng)基。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染48 h 后取樣拍照。采用Image J 計(jì)算劃痕面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IOSE80 與ES-2 內(nèi)Hsa-miR-29c-5p 的表達(dá)水平比較

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，ES-2 內(nèi)Hsa-miR-29c-5p 的表達(dá)水平低于IOSE80，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 IOSE80 與ES-2 中Hsa-miR-29c-5p 表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組轉(zhuǎn)染結(jié)果比較

轉(zhuǎn)染48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察可見兩組均有均勻明亮的紅色熒光，表明Hsa-miR-29c-5p mimics及miR-NC 均轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，見圖2。qRTPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組Hsa-miR-29c 的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3。

圖2 熒光顯微鏡檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)染情況(100×)

圖3 兩組轉(zhuǎn)染結(jié)果比較

2.3 Hsa-miR-29c-5p 對(duì)ES-2 細(xì)胞增殖及遷移的影響

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染72、96 h 后的增殖速率低與同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖4。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h 后ES-2 細(xì)胞的橫向遷移能力被抑制。見圖5。轉(zhuǎn)染48 h 后，轉(zhuǎn)染組劃痕面積大于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖6。

與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，**P ＜0.01

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（100×）

圖6 轉(zhuǎn)染48 h 后兩組劃痕面積比較

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 通過多個(gè)靶向轉(zhuǎn)錄本，參與多種與多個(gè)細(xì)胞過程相關(guān)的惡性行為[18-20]，并且在腫瘤相關(guān)變化（包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)移）中發(fā)揮著非常重要的作用[21]。有研究表明，膽囊癌中Hsa-miR-29c-5p 通過使MAPK/ERK通路失活而參與細(xì)胞凋亡，進(jìn)而激活caspase 9/caspase 3/PARP 通路[22]。

OCCC 腫瘤大多為囊實(shí)性，直徑為3～30 cm。其典型組織學(xué)特征表現(xiàn)為管狀、囊狀、乳頭狀和實(shí)性結(jié)構(gòu)，瘤細(xì)胞最常見為透明細(xì)胞或呈鞋釘樣。OCCC 平均發(fā)病年齡為55 歲，比漿液性癌發(fā)病年齡提前了5～6 年[23]。OCCC 作為病理形態(tài)、分子生物學(xué)及臨床特征特殊的一類腫瘤逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究通過siRNA 轉(zhuǎn)染法成功過表達(dá)ES-2 的Hsa-miR-29c-5p，并進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染效率。CCK-8 實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組增殖能力及細(xì)胞遷移能力顯著低于同種細(xì)胞的對(duì)照組，這提示過表達(dá)Hsa-miR-29c-5p可抑制ES-2 細(xì)胞的增殖及遷移，Hsa-miR-29c-5p有望成為OCCC 新的診治靶點(diǎn)。