孫延平，劉 艷，楊炳友，王 蒙，王秋紅，匡海學(xué)

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 藥用資源開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023；3.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院 中藥炮制學(xué)教研室，廣東 廣州512000）

近20年來(lái)，由于中藥中多糖類成分具有多方面的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、抗凝血、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等，引起了醫(yī)藥學(xué)和化學(xué)界越來(lái)越多的關(guān)注和重視，中藥多糖具有廣闊的新藥開(kāi)發(fā)前景。然而，中藥多糖大多是用水溶液提取獲得，因而中藥多糖被提取的過(guò)程中，同樣是水溶性的蛋白質(zhì)也被同時(shí)提取出來(lái)，干擾了后續(xù)多糖的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的測(cè)定。因此，多糖脫蛋白是中藥多糖實(shí)際應(yīng)用中首要解決的問(wèn)題。近年來(lái)，樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中生物活性成分的純化，樹(shù)脂具有回收率高、選擇性好、吸附條件溫和、操作成本低、易于再生等優(yōu)點(diǎn)，可以獲得純度較高的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的研究提供了極大的便利。本文從樹(shù)脂脫蛋白原理、影響因素及樹(shù)脂在中藥多糖脫蛋白中的應(yīng)用兩方面對(duì)近15年的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行總結(jié)，為實(shí)際中藥多糖生產(chǎn)開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 樹(shù)脂脫蛋白原理及影響因素

1.1 樹(shù)脂脫蛋白原理

大孔吸附樹(shù)脂，是一種耐用性強(qiáng)的極性、非極性或微親水性聚合物，具有很高的吸附能力。它可以通過(guò)靜電作用、氫鍵作用、絡(luò)合作用和分子篩作用選擇性地吸附水和非水體系中的目標(biāo)組分。因此，大孔吸附樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于生物粗樣品中目標(biāo)成分與其它雜質(zhì)的分離。與化學(xué)法相比，大孔吸附樹(shù)脂作為粗多糖提取液的脫蛋白試劑具有操作成本低、溶劑消耗少、易再生等優(yōu)點(diǎn)，能夠不破壞多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性而同時(shí)去除粗多糖提取物中的蛋白質(zhì)。

離子交換樹(shù)脂，由于離子交換樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附性不強(qiáng)，而蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH值，使蛋白質(zhì)處于離子狀態(tài)，使其吸附性增大。例如：在堿性條件下蛋白以陰離子形式存在，吸附在陰離子樹(shù)脂上；在酸性條件下其以陽(yáng)離子形式存在，在陰離子樹(shù)脂上的吸附性顯著降低，因此，可通過(guò)改變酸度將蛋白質(zhì)從陰離子樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。但當(dāng)樹(shù)脂的吸附能力降低時(shí)，須對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行再生。

1.2 樹(shù)脂對(duì)脫蛋白影響因素

大孔吸附樹(shù)脂對(duì)于中藥多糖的脫蛋白率有6大主要影響因素：

（1）pH值pH值通常通過(guò)改變多糖溶液中蛋白質(zhì)和多糖的解離狀態(tài)來(lái)影響樹(shù)脂的吸附效率。

（2）溫度 吸附溫度是影響樹(shù)脂法脫蛋白效果的重要因素。升高溫度可以使溶質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)增加，有利于蛋白質(zhì)的吸附，但升到一定溫度下，吸附會(huì)達(dá)到飽和。因此，要選擇合適的吸附溫度。

（3）處理間 延長(zhǎng)吸附時(shí)間可以提高樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，從而提高其脫蛋白率。然而，較長(zhǎng)的吸附時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致多糖的損失。

（4）樹(shù)脂用量 很明顯，樹(shù)脂柱的高徑比代表了樹(shù)脂柱床體積，隨著體積的增大，樹(shù)脂與蛋白質(zhì)的交換能力增加，但交換能力最終會(huì)達(dá)到飽和。

（5）多糖溶液濃度 當(dāng)多糖溶液濃度增大時(shí)，樹(shù)脂吸附會(huì)達(dá)到飽和。

（6）流速 隨著流速的增加，脫蛋白率會(huì)逐漸降低，緩慢的流速有利于蛋白在樹(shù)脂上的顆粒擴(kuò)散和膜擴(kuò)散，從而與樹(shù)脂進(jìn)行離子交換。另外，近15年來(lái)諸多學(xué)者采用了多種不同的樹(shù)脂材料對(duì)中藥多糖脫蛋白效果進(jìn)行測(cè)試（部分樹(shù)脂物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表1），結(jié)果表明，每種樹(shù)脂材料的物理性質(zhì)和化學(xué)吸附性質(zhì)也同時(shí)決定了脫蛋白效率。

表1 部分樹(shù)脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.1 Physical structure parameters of part of resins

2 樹(shù)脂在中藥多糖脫蛋白中的應(yīng)用

2.1 植物多糖

2.1.1 根及根莖類多糖 丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza的干燥根和根莖，丹參多糖具有免疫增強(qiáng)作用，湯偉等人[1]為了精制丹參多糖去除蛋白，對(duì)4種大孔吸附樹(shù)脂純化多糖效能進(jìn)行了比較，篩選出DB-301型樹(shù)脂脫蛋白效果較好，脫蛋白率高達(dá)97.90%，而且多糖純度可達(dá)80%左右。人參為參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根莖，人參多糖可抗腫瘤，其增強(qiáng)免疫功能較強(qiáng)，陳巧巧等人[2]用靜態(tài)吸附去除人參多糖中蛋白質(zhì)，從5種樹(shù)脂中篩選出JK008型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂最為有效，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了動(dòng)態(tài)吸附條件如下：上柱重量（藥材∶干樹(shù)脂）設(shè)置為1∶1，直徑高度比設(shè)置為1∶7，洗脫量為3BV。最終可使蛋白脫除率達(dá)到84.38%，糖醛酸保留率為84.90%。西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefolium的干燥根，西洋參多糖具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種活性，Yu等人[3]在分離純化西洋參多糖的過(guò)程中，將10mg·mL-1的西洋參多糖溶液經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂柱色譜（20g）（Φ16mm×300mm）洗脫，蛋白去除率為95.42%，多糖損失率為10.86%，結(jié)果顯示，聚酰胺樹(shù)脂柱法優(yōu)于其它3種除蛋白方法Sevag法、TCA法和木瓜蛋白酶法。恰瑪古為Brassica rapa維族醫(yī)藥常用中藥，主要藥用部位為肉質(zhì)塊根，具有滋陰潤(rùn)肺等功效，陳卓爾等人[4]通過(guò)靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附對(duì)比和篩選了9種樹(shù)脂對(duì)恰瑪古粗多糖的脫色脫蛋白作用，結(jié)果表明，采用HPD500型樹(shù)脂，多糖濃度1%，以流速3.6BV·h-1進(jìn)行洗脫，0.75BV為上樣量，多糖保留率、脫色率、蛋白質(zhì)脫除率3項(xiàng)綜合評(píng)分相對(duì)較高。

2.1.2 莖類多糖 紅心火龍果莖為仙人掌科量天尺屬植物哥斯達(dá)黎加量天尺Hylocereus costaricensis的莖，火龍果莖多糖，具有美白等多種活性，馬若影等人[5]經(jīng)6種樹(shù)脂的篩選，認(rèn)為其中AB-8型樹(shù)脂對(duì)紅心火龍果莖多糖的蛋白去除效果最佳，以樹(shù)脂的用量0.6g·mL-1，溫度60℃，pH值為5及時(shí)間2h為條件，脫蛋白最優(yōu)，去除率可達(dá)88.29%，此時(shí)多糖保留率為83.47%。Shi等人[6]應(yīng)用一種含有α-氨基膦酸鹽基團(tuán)的Zn2+金屬離子熬合樹(shù)脂（LKC100型樹(shù)脂），對(duì)香蒲科植物水濁香蒲Typha angustifolia L.假莖多糖中的蛋白進(jìn)行去除，吸附洗脫條件為：粗多糖濃度1.5mg·mL-1，吸附時(shí)間30min，初始pH值為7.0，吸附溫度30℃，流速1.5BV·h-1，樹(shù)脂柱的徑高比為1∶15。此條件下，香蒲多糖中蛋白去除率和多糖保留率分別為（69.20±0.62）%和（87.50±0.76）%。

2.1.3 葉類多糖 枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica的干燥葉，近期研究表明，枇杷葉多糖具有抗氧化作用，戴婉妹等人[7]從6種樹(shù)脂中篩選出ADS-7型樹(shù)脂去除枇杷葉多糖中的蛋白最佳，采用10%乙醇洗脫回收多糖，此條件下多糖的解析率為69.65%，再用95%乙醇洗脫蛋白質(zhì)，蛋白解析率為89.58%，此外，此方法還可將ADS-7型樹(shù)脂再生利用。普洱茶為山茶科植物普洱茶Camellia sinensis的葉，普洱茶多糖具有增強(qiáng)免疫、降血糖、降血脂等功能，楊新河等人[8]篩選了10種樹(shù)脂，其中D101型樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，經(jīng)靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，4因素最佳條件為：溫度50℃、樹(shù)脂用量11mL、pH值為4.0、料液質(zhì)量濃度3.8mg·mL-1。此條件普洱茶多糖中蛋白去除率可達(dá)70.89%。淫羊藿為小檗科植物淫羊蕾Epimedium brevicornu的干燥葉，淫羊藿多糖被發(fā)現(xiàn)有改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，李瑞軍等人[9]從淫羊藿多糖中蛋白去除效果上，ADS-7型樹(shù)脂明顯優(yōu)于其他3種大孔吸附樹(shù)脂，淫羊藿粗多糖溶液為18.59mg·mL-1，pH值為5.0，v=1.5BV，洗脫體積控制在2倍柱體積，該方法具有較高的去除效率，蛋白含量由1.2%下降到0.035%。

2.1.4 果實(shí)類多糖 無(wú)梗五加為五加科五加屬植物Eleutherococcus sessiliflorus的果實(shí)，無(wú)梗五加果多糖具有抗疲勞等多種藥理活性，馮穎等人[10]為了脫除無(wú)梗五加果粗多糖中蛋白，考察了4種大孔吸附樹(shù)脂，認(rèn)為HPD-400型樹(shù)脂優(yōu)于其他3種，且當(dāng)條件設(shè)置為上樣量和洗脫劑用量均為2個(gè)柱床體積（20mL）時(shí)，HPD-400型樹(shù)脂蛋白去除率可達(dá)89.37%，多糖含量由原來(lái)的20.5%提高到83%。現(xiàn)代研究表明，無(wú)患子科植物龍眼Dimocarpus longan多糖具有抗氧化、保肝等功能，易陽(yáng)等人[11]從兩種陰離子交換樹(shù)脂和6種大孔吸附樹(shù)脂篩選出陰離子交換樹(shù)脂D301-F型樹(shù)脂，對(duì)龍眼多糖中蛋白的去除效果最好，多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，料液比0.16g·mL-1，pH值為5，溫度為50℃，此時(shí)蛋白質(zhì)去除率為73.12%，多糖保留率為85.75%。藍(lán)海波等人[12]考察了7種樹(shù)脂，結(jié)果表明，D301-R型樹(shù)脂在溫度為48℃，pH值為5.0，樹(shù)脂用量為0.61g·mL-1及時(shí)間為2.0h的條件下，龍眼多糖蛋白去除率為91.83%，明顯優(yōu)于其他6種樹(shù)脂。

2.1.5 種子類多糖 銀杏果是銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba）種子，楊強(qiáng)等人[13]從6種大孔吸附樹(shù)脂和兩種離子交換樹(shù)脂篩出脫色1號(hào)樹(shù)脂對(duì)銀杏果多糖的脫蛋白效果最好，在最優(yōu)的條件下（pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5mL·min-1，上樣濃度為4mg·mL-1，柱容量為2BV），蛋白去除率為88.39%，多糖保留率為79.12%。狀元豆為豆目蝶形花亞科大萊豆Phaseolus limensis，具有祛濕、補(bǔ)血等功效，黎英等人[14]從10種樹(shù)脂中，篩選出D113型樹(shù)脂對(duì)狀元豆粗多糖除蛋白效果最佳，在室溫25℃下，上樣濃度為4.1mg·mL-1，pH值為5.5，流速為1.6mL·min-1，上樣體積為2.9BV時(shí)，蛋白去除率和多糖保留率分別達(dá)（90.24±0.87）%和（94.07±1.15）%。使用后用30%乙醇洗脫液洗脫可讓樹(shù)脂再生。

2.1.6 花類多糖 款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，款冬花多糖可抑制白血病細(xì)胞，Zhao等人[15]靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察5種樹(shù)脂，LS-206型樹(shù)脂對(duì)款冬花多糖的脫色率高于其他樹(shù)脂，再通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附曲線，25℃溫度下，流速1.5BV·h-1，5mg·mL-1款冬花多糖用量為2BV，在此條件下，款冬花多糖的蛋白去除率為91.42%，多糖回收率為85.38%。宋逍等人[16]通過(guò)靜態(tài)試驗(yàn)從5種樹(shù)脂中再次確定LS-206型樹(shù)脂對(duì)款冬花多糖脫除蛋白效果最好，動(dòng)態(tài)吸附條件為：上柱高徑比15，溫度30℃，上柱體積2BV，多糖溶液濃度6mg·mL-1，上柱速率1.5BV·h-1。此條件下的款冬花多糖的脫蛋白率為87.70%，多糖保留率為87.89%。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，金銀花多糖具有抗菌等活性，何俊婷[17]為了對(duì)金銀花多糖進(jìn)行純化脫除雜質(zhì)，對(duì)比7種大孔吸附樹(shù)脂，并最終篩選出LS-206型樹(shù)脂進(jìn)行除雜，上樣濃度為3mg·mL-1，上樣量為1.4BV，流速設(shè)置為1.5BV·h-1，在此條件下，金銀花多糖脫蛋白率為83.83%，多糖保留率為81.29%。

2.1.7 皮類多糖 厚樸為木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸Magnolia officinalis的干燥干皮、根皮及枝皮，厚樸多糖具有一定抗抑郁活性，藍(lán)閩波等人[18]從6種大孔吸附樹(shù)脂中，通過(guò)靜態(tài)吸附法篩選出ADS-7型大孔樹(shù)脂對(duì)厚樸多糖的效果最佳，ADS-7屬?gòu)?qiáng)極性樹(shù)脂，對(duì)0.1%厚樸粗多糖的脫蛋白率能達(dá)到91%。

2.1.8 全草類多糖 二色補(bǔ)血草為白花丹科植物二色補(bǔ)血草Limonium bicolor的帶根全草，二色補(bǔ)血草多糖可抑制hela細(xì)胞體外生長(zhǎng)，Zhang等人[19]為了去除二色補(bǔ)血草多糖中的蛋白，從5種不同樹(shù)脂中篩選出LX-46型樹(shù)脂效果最好，經(jīng)進(jìn)一步條件優(yōu)化，各參數(shù)設(shè)置為：流速1.5BV·h-1，上樣量2BV，室溫下多糖樣品溶液濃度6mg·mL-1，此條件下，蛋白去除率達(dá)92.79%，同時(shí)多糖的保留率為86.53%。

2.1.9 殘?jiān)皦赫ノ镱惗嗵?葫蘆科植物南瓜Cucurbita moschata多糖具有體外抑菌等活性，Yang等人[20]比較了6種不同極性、直徑和表面的樹(shù)脂，對(duì)南瓜多糖溶液進(jìn)行脫蛋白試驗(yàn)，篩選出S-8型樹(shù)脂效果最好，經(jīng)動(dòng)態(tài)吸附和解吸測(cè)試，S-8型樹(shù)脂最佳吸附條件為：粗多糖溶液濃度1mg·mL-1；處理量2BV；流速1mL·min-1；溫度20℃。S-8型樹(shù)脂最佳解吸條件：8BV的NaCl溶液（50mM，pH值7.0）和8BV的乙醇-水（70∶30，v/v）作為洗脫液，流速為1mL·min-1。此條件下，脫蛋白率為（75.9±0.9）%，多糖保留率為（84.7±1.2A）%，綜合效用優(yōu)于H2O2和Sevage試劑法。紫蘇子為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens的干燥成熟果實(shí)，紫蘇籽制取紫蘇籽油后的主要加工副產(chǎn)物即為紫蘇粕，紫蘇粕多糖具有抗氧化活性，朱建飛等人[21]通過(guò)靜態(tài)吸附測(cè)試，認(rèn)為D101型樹(shù)脂優(yōu)于其他7種大孔吸附樹(shù)脂，可以使紫蘇粕多糖提取液的脫蛋白效果最大，動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)顯示D101型樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附中對(duì)于多糖的回收率為88.43%，高于其他樹(shù)脂。

2.2 菌類多糖

香菇為真菌類擔(dān)子菌綱傘菌目傘菌科香蕈Lentinus edodes，以子實(shí)體入藥，具有抗腫瘤等功效，肖靜怡等人[22]對(duì)香菇多糖的脫蛋白效果進(jìn)行了考察，篩選了717型陰離子樹(shù)脂、JK008型陽(yáng)離子樹(shù)脂和AB-8型大孔樹(shù)脂3種類型樹(shù)脂，其中脫蛋白效率JK008型＞717型＞AB-8型，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂JK008可使香菇多糖脫蛋白率達(dá)到86.5%，多糖的保留率達(dá)到85%，且條件溫和。桑黃為多孔菌科植物針層孔Phellinus igniarius的子實(shí)體，可顯著提高人體免疫，秦俊哲和張慧洋[23]通過(guò)靜態(tài)吸附篩選出D-101-I型樹(shù)脂去除桑黃粗多糖的蛋白最好，優(yōu)于其他4種大孔吸附樹(shù)脂，動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)確定最佳條件為：室溫下，多糖液濃度300mg·mL-1，流速1mL·min-1，上樣量為2BV時(shí)蛋白的吸附率達(dá)90%；乙醇濃度為50%，用量為2BV時(shí)，蛋白脫除率達(dá)83.9%，多糖損失率為25.1%。赤靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum的干燥子實(shí)體，赤靈芝多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗皰疹等多種生物活性，Jiang等人[24]從不同類型的離子交換樹(shù)脂中，綜合考慮對(duì)赤靈芝多糖蛋白的去除率和赤靈芝多糖的回收率，最終篩選出A103S型陰離子交換樹(shù)脂效果最佳，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化各因素水平，確定最優(yōu)條件為：樣品濃度10mg·mL-1，樣品體積100mL，樣品流速2mL·min-1，洗脫流速40mL·min-1。此條件測(cè)試結(jié)果，赤靈芝多糖蛋白去除率和多糖回收率為88.52%和85.06%。

2.3 其他類多糖

蟲(chóng)白蠟為介殼蟲(chóng)科昆蟲(chóng)白蠟蟲(chóng)Ericerus pela的雄蟲(chóng)，群棲于木犀科植物白蠟樹(shù)、女貞或女貞屬他種植物枝干上分泌的蠟精制而成，蟲(chóng)白蠟多糖具有抗氧化免疫等功效，何釗等人[25]從12種不同結(jié)構(gòu)參數(shù)的大孔吸附樹(shù)脂中，優(yōu)選篩出NKA-9型樹(shù)脂對(duì)于蟲(chóng)白蠟多糖中蛋白的去除率最好，吸附條件優(yōu)化為pH值為8.0，溫度為30℃，蟲(chóng)白蠟多糖溶液濃度為10mg·mL-1，以1BV·h-1流速上樣1BV后，以5BV水洗脫，此時(shí)脫蛋白率為51.9%、多糖回收率為60%。

3 結(jié)論

到目前為止，多糖脫蛋白技術(shù)已被學(xué)術(shù)界廣泛研究，采用了除樹(shù)脂外的多種方法，包括廣泛使用的Sevag法、三氯乙酸法、凍融（FTT）法。然而，Sevag法和三氯乙酸法都是化學(xué)試劑，有毒且難以放大，并且需要復(fù)雜和多步驟的過(guò)程，導(dǎo)致脫蛋白率低，多糖損失大，甚至可能降低多糖的生物活性。雖然凍融脫蛋白無(wú)毒，但需要耗費(fèi)時(shí)間和熱量。然而，樹(shù)脂脫蛋白法保留了多糖的特征官能團(tuán)、單糖組成和分子量。重要的是，樹(shù)脂脫蛋白不消耗任何有毒的有機(jī)試劑。樹(shù)脂是一種對(duì)環(huán)境友好的多糖脫蛋白方法，有望在未來(lái)取代常用的Sevag法等傳統(tǒng)方法，而被廣泛應(yīng)用。