張 芳，張 鑫，楊海山，王志博，汪明香，沈國平，王 嶸，朱德銳

(青海大學醫(yī)學院，基礎醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810001)

有學者認為[1]，美白劑是通過抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的合成反應鏈，減少其在皮膚內(nèi)的生成繼而達到祛斑美白效果，但美白劑對酪氨酸酶的抑制作用機理及類型不明。本研究擬對四氫嘧啶(Ectoine)對酪氨酸酶的抑制作用機制及類型開展研究。

1.材料與方法

1.1 主要材料和試劑

Ectoine(純度≥95%)購自德國Fluka Analytical公司；維生素C乙基醚(VC乙基醚)購自山東優(yōu)索化工公司；海藻糖與熊果苷購自河北千匯生物公司；煙酰胺購自北京Solarbio科技公司；L-酪氨酸和酪氨酸酶(活力2.5*103U)購自合肥博美生物科技有限公司。JB/T-5374-1991型電子天平(精確率0.1mg)購自德國梅特勒-托利多公司；501型超級恒溫水浴箱購自常州國華電器公司；Mili-Q Integral型純水儀購自法國默克化工公司；754型紫外可見分光光度計購自上海光譜儀器有限公司。

1.2 研究方案

酪氨酸酶(Tyrosinase)是體內(nèi)黑色素生物合成的關鍵靶點[2]。抑制劑通過抑制酪氨酸酶活力使黑色素顆粒生成減少從而達到美白功效。據(jù)此設計研究方案如下：用分光光度法測定不同質量分數(shù)的Ectoine及與美白劑復配時對酪氨酸酶活力的抑制率；之后固定L-酪氨酸濃度，加入不同活力的酪氨酸酶，測定不同質量分數(shù)Ectoine對酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化活力的影響，判斷反應類型；再固定酪氨酸酶活力，改變L-酪氨酸濃度，考察不同質量分數(shù)Ectoine對酶活力的影響，以 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷Ectoine的抑制類型。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

磷酸緩沖溶液(PBS緩沖液)的配置：精密稱取Na2HPO43.55 g、NaH2PO43.90 g，混合后用去離子水溶解定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH約6.8左右。1.0 mmol/L酪氨酸溶液的配制：精密稱取L-酪氨酸0.18 g，加入5 mL鹽酸(0.1mol/L)溶解后，加約95 mL PBS緩沖液，調(diào)節(jié)pH約6.8左右，后定容至100 mL。酪氨酸酶溶液的配置：將酪氨酸酶(酶活力：2.5×103U)溶于250 mL PBS緩沖液中，制成酶活力為100 U/mL的酪氨酸酶溶液。上述配制溶液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酪氨酸酶抑制率測定

酪氨酸酶抑制率測定參照文獻[3]方法，反應液組成與配比見表1。將L-酪氨酸溶液、PBS緩沖液和測試液依次加入A1、A2、A3和A4試管中，充分混勻，置37 ℃恒溫水浴箱加熱5 min。再將酪氨酸酶溶液依次加入到A1、B1試管中混勻，反應15 min，測定各組吸光值(475 nm)并計算抑制率(I%)。I%=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]，式中A1、A2、B1和B2為各組的吸光度值。

1.3.3 Ectoine對酪氨酸酶的抑制率測定

配制不同濃度的Ectoine水溶液，質量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，參照1.3.2方法測定酪氨酸酶抑制率。

1.3.4 Ectoine與美白劑復配時對酪氨酸酶的抑制率測定

選取0.5%熊果苷、2.0%煙酰胺和2.0%VC乙基醚[4]與不同質量分數(shù)的Ectoine進行復配，參照1.3.2方法測定酪氨酸酶抑制率。

1.3.5 對酪氨酸酶活性的抑制性質分析

在同一底物酪氨酸質量濃度下，測定不同質量濃度的Ectoine對酪氨酸酶活性的抑制作用。固定底物L-酪氨酸濃度(1.0mmo/L)，改變酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine質量分數(shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測定吸光值A475。以酪氨酸酶的活性作為橫坐標，A475作為縱坐標，分析不同質量分數(shù)下Ectoine對酪氨酸酶活性的抑制關系。

1.3.6 對酪氨酸酶活性的抑制動力學分析

為確定Ectoine的抑制類型，對Ectoine進行動力學實驗，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖得動力學曲線，探討抑制劑對酶促反應的抑制類型[5]。固定酪氨酸酶含量(100U/mL)，改變底物L-酪氨酸質量濃度(0.25、0.5和0.75和1.0mmol/L)和Ectoine質量分數(shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測定吸光度值A475。以底物L-酪氨酸濃度的倒數(shù)值為橫坐標，以A475的倒數(shù)值為縱坐標，確定Ectoine的抑制類型。

1.4 統(tǒng)計學方法

2.結果

2.1 Ectoine對酪氨酸酶的抑制率

不同濃度的Ectoine(質量分數(shù)%，w/v)對酪氨酸酶的活性抑制率見圖1和表2。圖1和表2顯示，酪氨酸酶的活性抑制率隨Ectoine的濃度升高而抑制效果增加，當Ectoine濃度為2.0%時，其平均抑制率為36.33%。當Ectoine濃度大于2.0%時，抑制率升高趨勢平緩，計算可知半抑制濃度(IC50)為4.58 g/L。由此表明Ectoine能夠抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生物合成，具備潛在的美白效果。

表2 不同質量分數(shù)的Ectoine對酪氨酸酶的抑制率

圖1 Ectoine對酪氨酸酶的抑制率

2.2 復配使用Ectoine與美白劑對酪氨酸酶的抑制率

不同濃度(質量分數(shù))的Ectoine分別與3種美白劑(脫氧熊果苷、煙酰胺和VC乙基醚)進行復配，測得的酪氨酸酶活性抑制率見表3。表3顯示，脫氧熊果苷與Ectoine復配時，7個濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明Ectoine不能促進熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制率。當Ectoine與煙酰胺復配時，7個濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均明顯上升(P<0.01)，表明Ectoine與煙酰胺復配對酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同促進效果。Ectoine與VC乙基醚復配時，7個濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均明顯上升(P<0.01)，表明Ectoine與VC乙基醚復配時，對酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同促進效果。此外，Ectoine對煙酰胺的促進作用總體上優(yōu)于VC乙基醚，且在質量分數(shù)為2.5%時，抑制率約為66.17%，抑制效果最佳。

表3 不同質量分數(shù)的Ectoine與三種美白劑復配時對酪氨酸酶的抑制率

2.3 Ectoine對酪氨酸酶的抑制性質分析

由2.1結果可知，當Ectoine濃度大于2.0%時，抑制率升高趨勢平緩，故選取2.0%(含2.0%)的4個質量分數(shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5%)進行動力學實驗。固定底物L-酪氨酸酶濃度為1.0 mmol/L，改變酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine質量分數(shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測定吸光值A475，結果見圖 5。圖 5顯示，在相同酶活力下，隨著Ectoine質量分數(shù)的增高，A475吸光值逐漸變小，直線的斜率下降，說明Ectoine對酪氨酸酶的作用屬于可逆抑制。

圖2 不同質量分數(shù)的Ectoine對酪氨酸酶的抑制作用關系圖

2.4 Ectoine對酪氨酸酶的活性動力學分析

由2.3結果可知，Ectoine對酪氨酸酶活性的抑制屬于可逆抑制?？赡嬉种品譃楦偁幮汀⒎歉偁幮?、反競爭性型和線性混合型。固定底物酪氨酸酶含量(100U/mL)，改變L-酪氨酸酶濃度(0.25、0.5、0.75和1.0mmol/L)和Ectoine質量分數(shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測定吸光值A475，通過Lineweaver-Burk 取雙倒數(shù)圖判斷抑制類型，結果如圖3所示。圖3顯示，Ectoine質量分數(shù)為2.0%、3.0%、4.0%和5.0%時的線性方程分別為y=2.827x+10.67(R2=0.989)、y=3.212x+11.79(R2=0.990)、y=3.654x+13.49(R2=0.989)、y=4.105x+15.05(R2=0.995)，其中Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖相交于橫軸的一點，A475吸光值隨著Ectoine的質量分數(shù)增加而變小，抑制常數(shù)(Km=0.41g/L)不變，反應速度隨Ectoine質量分數(shù)增加而減小，符合非競爭性抑制類型的特征。

圖3 Ectoine抑制酪氨酸酶動力學曲線圖

3.討論

美白劑對酪氨酸酶的抑制作用機理各有不同，嚴航等[6]發(fā)現(xiàn)薏苡仁提取液對酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50為1.4 mg/mL，抑制類型為可逆線性混合型；孫勁毅等[7]發(fā)現(xiàn)茶皂素對酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50為48 g/L，抑制類型為可逆競爭性抑制；劉琦等[4]發(fā)現(xiàn)熊果苷、煙酰胺以及VC乙基醚對酪氨酸酶活性均具有抑制效果，抑制類型為可逆非競爭性抑制型。本研究結果顯示，Ectoine對酪氨酸酶具有一定抑制作用，IC50為4.58 g/L；Ectoine與VC乙基醚或煙酰胺復配時，酪氨酸酶的抑制效果明顯提高，尤以2.5% Ectoine最佳，抑制率分別為75.03%和66.17%；而Ectoine與脫氧熊果苷復配時對酪氨酸酶的抑制作用無明顯提高。另外，實驗通過分別固定L-酪氨酸濃度和酶含量，測定不同質量分數(shù)的Ectoine對酪氨酸酶抑制的影響，判斷其對酪氨酸酶活性的抑制作用類型和作用機制，結果表明Ectoine對酪氨酸酶的抑制類型和作用機制為可逆抑制中的非競爭性抑制，Km為0.41 g/L。故由結果可推斷Ectoine對酪氨酸酶的抑制作用是通過降低酶的活力，與酪氨酸酶分子上的獨立部位結合，而不與底物L-酪氨酸競爭活性中心。

綜上所述，Ectoine對酪氨酸酶有一定的抑制作用，與VC乙基醚、煙酰胺分別復配對酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同效果，其作用機制及類型為可逆抑制中的非競爭性抑制。