王 琦，張立雪，李淑楨，李長(zhǎng)興，吳佩峰，代冬芳*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730000)

有研究發(fā)現(xiàn)，二十五味鬼臼丸對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征(perimenopausal syndrome，MPS)有良好的預(yù)防及治療作用[1-3]，但機(jī)制不明。本研究以MPS大鼠模型為研究對(duì)象，檢測(cè)二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠模型血清激素的變化及子宮組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型的表達(dá)的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡SD雌性大鼠48只，體質(zhì)量200～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

戊酸雌二醇片(生產(chǎn)批號(hào)：201710BJ125)由拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)；二十五味鬼臼丸(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20140539)由青海省藏醫(yī)院生產(chǎn)；大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒由江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)；TRIzol Reagent由Ambion公司提供；PCR引物由TaKaRa公司提供；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒由天根生化科技公司提供；β-actin、大鼠ERα、ERβ多克隆抗體由Abcam公司提供；兔SP試劑盒由中杉金橋公司提供；

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

離心機(jī)由Eppendorf公司提供；多功能酶標(biāo)儀由BioRad公司提供；Nanodrop(2000)由Thermo公司提供；Light Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由Roche公司提供；熒光顯微鏡由Nikon公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模及給藥方法

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(OXV)、雌二醇組(OVX+E2)、二十五味鬼臼丸組(OVX+GJ)，每組12只。根據(jù)苗明三等[4]提供的方法制備MPS動(dòng)物模型，Sham組切除卵巢旁等體積脂肪組織，不摘卵巢，其余各組結(jié)扎血管后完整切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后給予青霉素(20萬U/只，肌肉注射，每天1次，連續(xù)3天)。術(shù)后第5 天對(duì)動(dòng)物逐只進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)5天若動(dòng)物不出現(xiàn)動(dòng)情期反應(yīng)則表示造模成功，OVX組有10只，OVX+E2和OVX+GJ組各有9只造模成功。術(shù)后2周開始給藥，OVX+E2組予戊酸雌二醇(0.1mg/kg，蒸餾水配成0.01mg/mL的混懸液)，OVX+GJ組予二十五味鬼臼丸(360mg/kg，蒸餾水配成0.36g/mL的混懸液)；Sham組和OVX組予等體積生理鹽水(灌胃，持續(xù)給藥12周)。給藥完成后于腹主動(dòng)脈取血并分離獲得上清液，取部分子宮組織置4%多聚甲醛液固定，取部分子宮置液氮保存。

1.2.2 血清FSH、LH、E2含量檢測(cè)方法

嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定血清FSH、LH、E2含量，將酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本濃度。

1.2.3 子宮ERα、ERβmRNA的表達(dá)檢測(cè)方法

取約100 mg子宮組織，按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度及純度后檢測(cè)吸光度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，記錄各樣本Ct值。運(yùn)用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)差異值，每個(gè)樣本的ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，基因序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 ERα、ERβ蛋白表達(dá)檢測(cè)方法

將5 μm子宮石蠟切片烤片(60℃，2h)，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、PBS(pH7.4)在脫色搖床上洗滌(3次，每次5min)。以高壓行抗原修復(fù)后，滴加一抗ERα(1：200)、ERβ(1：200)孵育(4℃)過夜。次日用PBS沖洗(3次，每次3min)后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育(30min)，用PBS沖洗(3次，每次3min)。每組切片在相同視野下(×200)選取3張，用Image 6.0軟件計(jì)算陽性結(jié)果灰度平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 二十五味鬼臼丸對(duì)MPS大鼠模型血清FSH、LH、E2表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與Sham組比較，OVX組大鼠血清E2降低(P<0.05)，而LH、FSH增高(P<0.05)。與OVX組比較，OVX+E2組和OVX+GJ組血清E2增高(P<0.05)，LH、FSH降低(P<0.05)，見表2。

表2 二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠血清E2、LH、FSH水平的影響結(jié)果

2.2 二十五味鬼臼丸對(duì)MPS大鼠模型子宮ERα、ERβmRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，OVX組ERαmRNA、ERβmRNA表達(dá)低于Shan組(P<0.05)，OVX+E2組表達(dá)高于OVX組(P<0.05)。與OVX組比較，OVX+GJ組ERαmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ERβmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組子宮ERα、ERβmRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 二十五味鬼臼丸對(duì)MPS模型大鼠子宮ERα和ERβ蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，ERα在Sham組主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，ERβ在除OVX組以外的各組大鼠子宮的腺上皮中均有表達(dá)，見圖1。與Sham組大鼠比較，OVX組ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。給藥12周后，與OVX組比較，OVX+E2組ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，OVX+GJ組ERα表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，ERβ的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，見表4。

圖1 二十五味鬼臼丸對(duì)子宮組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá)的影響圖(×200)

表4 各組子宮ERα、ERβ蛋白表達(dá)量

3.討論

ER是類固醇激素受體超家族的成員之一，能與雌激素特異性結(jié)合，其亞型有ERα和ERβ，前者主要分布在子宮、乳腺、膀胱、腦、垂體、卵巢，后者分布于心臟、骨、前列腺、唾液腺、睪丸等?！斑x擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”(selective estrogen receptor modulators，SERMs)是指對(duì)ERα或ERβ有激動(dòng)作用而對(duì)另一亞型無作用的藥物，其選擇性的關(guān)鍵是SERMs與ER形成復(fù)合體與蛋白聯(lián)合調(diào)解因子相互作用，進(jìn)而影響受體配體復(fù)合物轉(zhuǎn)錄的活性[5]。SERMs的激動(dòng)作用可通過轉(zhuǎn)錄激活因子1(activating transcription factor，AF-1)路徑激活基因轉(zhuǎn)錄分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，SERMs拮抗雌激素作用是通過其與ER競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止或抑制基因轉(zhuǎn)錄的輔調(diào)節(jié)蛋白因子與轉(zhuǎn)錄激活因子2(activating transcription factor，AF-2)表面的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。鬼臼與哺乳動(dòng)物的類固醇激素17β-雌二醇是具有相似結(jié)構(gòu)的多羥基化合物，因此在體內(nèi)能與ER結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，鬼臼類木脂素對(duì)ERβ的親和力高于ERα，對(duì)ERα的親和力約為內(nèi)源性雌激素的4%，對(duì)ERβ的親和力約為內(nèi)源性雌激素的87%；在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，其對(duì)ERβ的轉(zhuǎn)錄激活作用較ERα強(qiáng)1000倍。因此，推測(cè)ERβ可能是鬼臼類木脂素發(fā)揮作用的靶點(diǎn)。MPS最早表現(xiàn)為卵巢功能衰退，繼而表現(xiàn)為下丘腦-垂體功能退化、激素水平改變(E2，F(xiàn)SH，LH)，使其分泌抑制垂體的因子減少，導(dǎo)致下丘腦-垂體負(fù)反饋功能障礙，繼而使下丘腦-垂體-卵巢軸失衡，影響植物神經(jīng)中樞及其支配下的各臟器功能，出現(xiàn)一系列不同程度的軀體癥狀[8-9]。

本研究中的MPS模型大鼠血清E2表達(dá)水平降低，F(xiàn)SH、LH表達(dá)水平增高；ERα、ERβmRNA及蛋白水平下降。本研究結(jié)果與Katherine等[10]的結(jié)論一致。用二十五味鬼臼丸對(duì)模型大鼠連續(xù)干預(yù)12周后，血清E2表達(dá)水平增高、FSH、LH表達(dá)水平降低，說明二十五味鬼臼丸可有效降低因卵巢切除而引起的LH、FSH增高，這對(duì)于調(diào)節(jié)絕經(jīng)后內(nèi)分泌紊亂具有重要意義；RT-PCR結(jié)果顯示，大鼠子宮組織中ERαmRNA水平的表達(dá)無明顯上調(diào)，而ERβ的表達(dá)上調(diào)；免疫組化研究表明，ERα、ERβ可定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，與模型組組比較，二十五味鬼臼組的ERβ染色強(qiáng)度明顯大于ERα，本研究與唐雨晴等[11]的研究結(jié)果一致，說明二十五味鬼臼丸在大鼠子宮組織中與ERβ的親和力較高，通過提高ERβ表達(dá)水平，改善MPS大鼠激素水平。

本研究結(jié)果顯示，二十五味鬼臼丸對(duì)MPS大鼠血清激素及子宮組織ERβ具有調(diào)控作用，表現(xiàn)出“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”作用，這可能是其防治絕經(jīng)后MPS的作用機(jī)制之一。