姜 婷 嚴曉偉 王建榮

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院兒科，新疆烏魯木齊 830002

哮喘是一種慢性阻塞性氣道疾病[1]，兒童哮喘患病率呈逐年攀升趨勢[2]。烏魯木齊市兒童哮喘患病率也逐年上升，從0.61%[3]增加到2010 年1.01%[4]。環(huán)境和眾多基因共同決定哮喘是目前觀點，解整合素-金屬蛋白酶33 基因（ADAM33）是通過位置克隆識別的第一批哮喘候選基因之一[5]。多項研究證明漢族哮喘發(fā)病與ADAM33 基因S2 相關(guān)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）可促進ADAM33 的表達[9]，這過程通過TGF-β1 激活胞外信號調(diào)控激酶實現(xiàn)[10]。烏魯木齊冬季寒冷漫長，氣溫日差較大，年降水量稀少，這都是哮喘易感的環(huán)境因素[11]。該地區(qū)漢族哮喘兒童發(fā)病是否與上述研究結(jié)果一致，尚不清楚。本研究旨以ERK/TGF-β1 信號通路為基點，研究烏魯木齊市漢族哮喘兒童ADAM33 基因S2 表達是否受TGF-β1、ERK 影響，為哮喘患兒氣道重塑的發(fā)病機制深入認識提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年7 月—2019 年7 月新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院及第一附屬醫(yī)院門診及入院，3～14 歲的漢族支氣管哮喘患兒78 例作為哮喘組，選擇預(yù)防保健科就診的同期45 例漢族非哮喘兒童作為非哮喘組，兩組患兒性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。納入標準：哮喘患兒3 代均為生活在烏魯木齊1 年以上、互相沒有血緣關(guān)系，且不是外來的漢族居民。診斷標準：2016 年制訂的《兒童支氣管哮喘診斷和防治指南》[12]。排除標準：親屬中罹患哮喘的患者，有家族及個人過敏性疾病史，患兒近期有感染的病史，合并肝、腎、心、肺等疾病。經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查同意，家屬簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

抽取研究對象外周血4 mL 在含EDTA 的血常規(guī)抗凝試管中，保存在-30℃溫度，限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析ADAM33 S2 基因多態(tài)性；血清胞外信號調(diào)控激酶（ERK）、TGF-β1 及IgE 水平用酶聯(lián)免疫吸附分析法測定；引物合成和設(shè)計S2 rs號528557，下游引物（R）5’-TGAGAGCCCGAGGAGTG-3’、上游引物5’-GGGGAAC-CGCAGGAGTA-3’（上海捷瑞生物工程有限公司合成）。ADAM33 限制性酶切、特定片段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增：DNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL，超純水10 μL，2×TapMasterMix（北京百泰科生物技術(shù)有限公司）12.5 μL，共25 μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃終延伸5 min，共32 個循環(huán)，4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠中，在100 V 下電泳35 min，觀察結(jié)果。酶切反應(yīng)體系與條件：取PCR 產(chǎn)物10 μL，內(nèi)切酶BanI（由NEB 公司提供）0.5 μL，1×Buffer 5 μL，加入超純水14.5 μL，37℃恒溫酶切60 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠（EB 染色）電泳35 min，利用紫外線凝膠圖像系統(tǒng)觀察照像，判定基因型，結(jié)果錄入數(shù)據(jù)庫。血清TGF-β1、ERK、IgE 水平檢測：血清TGF-β1、ERK、IgE水平采用ELISA 測定（試劑盒來自博奧森生物、江萊生物；產(chǎn)品編號：bsk00568、JL10706、JL12745），方法詳見說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計算記錄等位基因和基因型頻率，基因型分布是否符合Hardy-Weinburg 平衡定律。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗。采用直線相關(guān)分析ADAM33 S2、TGF-β1、ERK 的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinburing 遺傳平衡定律

ADAM33 S2 有群體代表性，樣本分布達到了H-W遺傳平衡（P＞0.05）。見表2。

表2 Hardy-Weinburing 遺傳平衡（例）

2.2 基因多態(tài)性

2.2.1 ADAM33 PCR 擴增 結(jié)果見圖1。

圖1 ADAM33 S2 PCR 擴增

2.2.2 ADAM33 S2 PCR 產(chǎn)物酶切結(jié)果 S2 位點為G/C型，PCR 擴增產(chǎn)物基因片段總長度為458 bp，CC 純合子時，酶切產(chǎn)物顯示458 bp 的條帶；GG 純合子時，酶切產(chǎn)物顯示324 bp 和135 bp 的兩條條帶；CG 雜合子時，酶切產(chǎn)物顯示458、135 bp 和324 bp 的3 條條帶。見圖2。

圖2 ADAM33 S2 PCR 產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.3 兩組ADAM33 S2 等位基因和基因型頻率比較

兩組ADAM33 S2 CC、CG、GG 三種基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時等位基因頻率G、C 比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 兩組ADAM33 S2 基因型和等位基因頻率比較（例）

2.4 兩組IgE、TGF-β1、ERK 水平比較

非哮喘組IgE、TGF-β1、ERK 水平低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表4。

表4 兩組IgE、TGF-β1、ERK 水平比較（）

表4 兩組IgE、TGF-β1、ERK 水平比較（）

注：TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；ERK：胞外信號調(diào)控激酶

2.5 ADAM33 S2 與TGF-β1 與ERK 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，TGF-β1 與ADAM33 S2、ERK 呈正相關(guān)（r=0.244、0.308，P＜0.05），ADAM33S基因S2 與ERK 無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

哮喘是一種異質(zhì)性疾病[13]，由遺傳及環(huán)境共同影響所致[14]，目前從基因進行靶向防治成為慢性疾病防治的主要著手點。ADAM33 基因的多態(tài)性與兒童哮喘易感性有關(guān)[15]。本研究顯示ADAM33 S2 可能為烏魯木齊漢族哮喘兒童的易感基因。究其原因可能為：①影響膜結(jié)合生長因子、受體釋放；②分解細胞外基質(zhì)；③增加流動性；④影響細胞與間質(zhì)細胞基質(zhì)之間相互作用；⑤促進細胞增殖和分化[16]。

有文獻[17]報道，IgE 在過敏體質(zhì)中水平明顯升高，特異性IgE 可經(jīng)Fc 段與肥大細胞的FcR 受體結(jié)合，生成各種炎癥因子，如組胺、5-羥色胺等，使機體處于致敏狀態(tài)；機體再次接觸同種過敏原后，會釋放大量炎癥因子，引起支氣管平滑肌痙攣收縮、氣道黏膜通透性增加，發(fā)生氣道高反應(yīng)，誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作[18-19]。本研究顯示，非哮喘組IgE 水平低于哮喘組，再次證實兒童支氣管哮喘是過敏性疾病，IgE 會促進哮喘發(fā)作。

本研究顯示，哮喘組TGF-β1 水平高于非哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05），ADAM33 S2 與TGF-β1成正相關(guān)，提示TGF-β1 可能上調(diào)ADAM33 S2 的表達增加哮喘易感性。推測原因：TGF-β1 通過修飾ADAM33基因啟動子轉(zhuǎn)錄后組蛋白起作用，上調(diào)ADAM33 mRNA 表達，促使纖維細胞表達大量的α 平滑肌肌動蛋白向肌纖維母細胞分化，從而促進氣道重塑[20]。

本研究顯示，哮喘組ERK 水平高于非哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05），TGF-β1 與ERK 有相關(guān)性，提示ERK 可能上調(diào)TGF-β1 的分泌，促進炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，增加哮喘發(fā)病風(fēng)險。氣道炎癥是引起哮喘反復(fù)發(fā)作的主要原因[21]，F(xiàn)inlay 等[22]相關(guān)實驗證實，ERK 信號通路的活化，會促進趨化因子的表達及炎癥因子的釋放[23]，引起氣道持續(xù)高反應(yīng)，最終導(dǎo)致氣道重塑[24]，是通過TGF-β1 參與主導(dǎo)肺堿性成纖維生長因子的自分泌實現(xiàn)[24]。研究還顯示在抗原反復(fù)刺激氣道中，高TGF-β1 水平會促使氣道重塑、組織纖維化及氣道慢性阻塞，最終導(dǎo)致氣道不可逆損害[25]。

此外，ERK 與ADAM33 S2 無相關(guān)性?？?能為ADAM33 發(fā)揮作用是：①影響膜結(jié)合生長因子、受體釋放；②分解細胞外基質(zhì)；③增加流動性④影響細胞與間質(zhì)細胞基質(zhì)之間相互作用⑤促進細胞增殖和分化[16]，而ERK 發(fā)揮作用是TGF-β1 參與主導(dǎo)肺堿性成纖維生長因子自分泌，實現(xiàn)ERK 信號通路的活化，導(dǎo)致氣道持續(xù)高反應(yīng)，最終導(dǎo)致氣道重塑。兩者在促進氣道重塑的過程中沒有必然的聯(lián)系，所以ADAM33 S2 與ERK 無相關(guān)性。

綜上所述，烏魯木齊漢族哮喘兒童IgE 升高，再次證實哮喘兒童屬于過敏性疾病，烏魯木齊地區(qū)兒童漢族哮喘發(fā)生的易感基因之一可能為ADAM33 S2。ERK 可能會提高TGF-β1 的表達，TGF-β1 會上調(diào)ADAM33 S2 的表達，促進氣道重塑，增加哮喘發(fā)生的風(fēng)險。本實驗旨在從兒童哮喘關(guān)聯(lián)基因角度出發(fā)探討哮喘的發(fā)病機制，研究其上游信號的傳導(dǎo)通路，可能為兒童哮喘自基因水平提供理論依據(jù)，但因樣本數(shù)目不夠多，仍需更多的樣本量來進行下一步的研究，進而實現(xiàn)兒童哮喘預(yù)防的精準醫(yī)療。