董明月 黃 艷 周立華▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院國(guó)醫(yī)館，河南鄭州 450000

高血壓是各種原因引起的以動(dòng)脈血壓升高為主要表現(xiàn)的綜合征[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人口老齡化的加快、飲食生活方式的改變，高血壓發(fā)病率在全球各國(guó)呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，故加強(qiáng)對(duì)高血壓的防治工作刻不容緩。黨曉芳等[2]從藥智網(wǎng)和2015 版《中華人民共和國(guó)藥典臨床用藥須知·中藥成方制劑卷》中，以“高血壓”“降壓”為關(guān)鍵詞檢索治療高血壓的中成藥，發(fā)現(xiàn)治療高血壓的單味中藥使用頻率最高的是黃芩，因此，研究黃芩治療高血壓的作用機(jī)制十分有必要。黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩具有擴(kuò)張血管、降壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗感染、抗腫瘤、抗氧化等作用[4-5]。黃芩可阻斷平滑肌細(xì)胞膜上的電壓依賴型Ca2+通道和受體操縱型Ca2+通道，抑制細(xì)胞Ca2+的增高，以發(fā)揮降壓作用[6]；還可以通過(guò)擴(kuò)張血管而降壓[7]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，黃芩降壓的有效成分和作用機(jī)制尚不清楚，因此需要借助現(xiàn)代科學(xué)的方法——網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其進(jìn)行深入研究。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥潛在藥理作用和復(fù)雜分子機(jī)制的研究提供了指導(dǎo)[8]。故本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以黃芩為研究對(duì)象，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)黃芩治療高血壓的潛在作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分收集

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）[9]搜索“黃芩”，獲得全部活性成分信息。然后根據(jù)成分藥動(dòng)學(xué)吸收、分布、代謝、排泄參數(shù)進(jìn)一步篩選，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[10]。利用Uniprot[11]數(shù)據(jù)庫(kù)中的Uniprot KB檢索功能選擇“Reviewed”“Human”，將檢索結(jié)果以Excel 格式導(dǎo)出，再將篩選出的黃芩活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為人類基因名稱。

1.2 疾病靶點(diǎn)查詢

利用GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank，以“Hypertension”為檢索詞進(jìn)行高血壓疾病靶點(diǎn)的查詢。通過(guò)韋恩圖得到黃芩與高血壓相關(guān)靶點(diǎn)的交集。

1.3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別將黃芩-高血壓潛在作用靶點(diǎn)基因名、黃芩-高血壓潛在作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性化學(xué)成分輸入Cytoscape 3.7.2 軟件[12]繪制“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，將黃芩治療高血壓的靶點(diǎn)限定研究種類設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置分值＞0.9，刪除游離節(jié)點(diǎn)，來(lái)篩選高置信度數(shù)據(jù)。再利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的CytoNCA 插件，以Betweenness、Closeness、Degree中位數(shù)為卡值進(jìn)行2 次篩選，篩選出核心基因。

1.5 GO 富集分析與KEGG 通路分析

運(yùn)用R 語(yǔ)言對(duì)黃芩活性成分治療高血壓的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分及藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

共得到黃芩活性成分36 個(gè)，檢索到107 個(gè)成分作用靶點(diǎn)。檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，合并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得5817 個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)韋恩圖取交集，得到黃芩與高血壓相互作用靶點(diǎn)共86 個(gè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 中藥-疾病靶標(biāo)韋恩圖

2.2 疾病靶點(diǎn)與成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制黃芩治療高血壓的“活性成分-靶點(diǎn)”，總共包括117 個(gè)節(jié)點(diǎn)（86 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、31 個(gè)藥物活性成分節(jié)點(diǎn)）和308 條邊，其中六邊形代表黃芩的化合物，四邊形代表藥物靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。依據(jù)節(jié)點(diǎn)的大小和節(jié)點(diǎn)度的高低排名，靠前的活性成分有MOL000173（漢黃芩素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL002714（黃芩素）、MOL000358（β-谷甾醇）。

圖2 黃芩的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芩治療高血壓的86 個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置分值>0.9，刪除游離節(jié)點(diǎn)，以篩選高置信度數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的CytoNCA 插件，以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector 中位數(shù)為卡值進(jìn)行2 次篩選，篩選出核心基因，見(jiàn)圖4。

圖3 中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 黃芩作用于高血壓的“靶點(diǎn)-通路”核心

2.4 GO 功能富集分析結(jié)果

將黃芩治療高血壓的86 個(gè)潛在靶點(diǎn)從分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）3 個(gè)水平進(jìn)行GO 分子功能富集。結(jié)果顯示，BP 分析取排名靠前的分析結(jié)果，包括細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)等。CC 分析包括突觸前膜的組成部分、膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域等。MF 分析取排名前10 的分析結(jié)果，包括G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、類固醇激素受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合等。見(jiàn)圖5。

圖5 GO 富集分析柱狀圖

2.5 KEGG 通路富集結(jié)果

KEGG 富集結(jié)果顯示，最顯著的信號(hào)通路是卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、PI3K-Akt 信號(hào)通路。其他通路還包括p53 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等。見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG 富集分析柱狀圖

3 討論

高血壓是西醫(yī)病名，中醫(yī)古籍并無(wú)相對(duì)應(yīng)病名，多歸類于“眩暈”“頭痛”范疇。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在高血壓的診斷、病理機(jī)制及治療上認(rèn)識(shí)較全面，能對(duì)血壓升高的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，可以迅速降壓，降低并發(fā)癥的發(fā)生。但長(zhǎng)期服用降壓藥，存在患者依從性差、容易耐藥等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，許多中藥不僅能改善高血壓癥狀，還能改善血管內(nèi)皮，抑制腎素活性、胰島素抵抗的影響[13]等。這是中國(guó)醫(yī)學(xué)防治高血壓的特色和優(yōu)勢(shì)所在。

在“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中，靠前的活性成分有漢黃芩素、黃芩素、豆甾醇、β-谷甾醇。董紅敬等[14]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)黃芩中的漢黃芩素、黃芩素等8 種化合物作用靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃芩與水腫、高血壓、心臟病等多種疾病相關(guān)。黃芩煎劑提取物能不同程度地降低麻醉大鼠和犬的血壓，其中黃芩素對(duì)血管平滑肌具有雙重調(diào)節(jié)作用[15]。黃芩治療高血壓最相關(guān)的8 個(gè)核心靶點(diǎn)為ESR1、AKT1、FOS、JUN、CCND1、CDKN1A、TP53、MAPK14，推測(cè)黃芩活性成分可能通過(guò)這些靶點(diǎn)來(lái)降壓。Tan 等[16]發(fā)現(xiàn)ESR1 是通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達(dá)，增加血管內(nèi)NO 釋放來(lái)舒張血管。Mercuro 等[17]發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后婦女中的雌激素對(duì)血壓正常者影響較小，但是對(duì)高血壓患者則可降低其收縮壓和舒張壓。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[18]，Akt1 通過(guò)激活內(nèi)皮一氧化氮合酶磷酸化和隨后產(chǎn)生一氧化氮來(lái)調(diào)節(jié)血管舒張，從而調(diào)節(jié)血壓。血管緊張素Ⅱ濃度常用作高血壓診斷及研究的重要指標(biāo)。曾武濤等[19]研究顯示，血管緊張素Ⅱ可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞原癌基因c-fos表達(dá)，并呈量效關(guān)系。卡地爾江·牙生等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，模型組c-fos 與c-jun 基因mRNA 表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)，心肌舒張因子SERCA-2a 蛋白的表達(dá)量跟c-jun 表達(dá)量有關(guān)。

GO 生物過(guò)程分析結(jié)果顯示，黃芩治療高血壓與氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇激素受體活性、兒茶酚胺結(jié)合等相關(guān)，提示黃芩通過(guò)多種途徑來(lái)發(fā)揮降壓作用。KEGG分析結(jié)果顯示，黃芩治療高血壓最為顯著的信號(hào)通路為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、PI3K-Akt 信號(hào)通路。目前對(duì)卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒的研究主要涉及卡波西肉瘤、腫瘤、皮膚病等，尚未涉及高血壓，其發(fā)病機(jī)制影響細(xì)胞的正常周期，而促使疾病的發(fā)生發(fā)展[21]。人巨細(xì)胞病毒感染[22-23]可導(dǎo)致氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能障礙，而內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)是高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。血管的收縮舒張功能不僅受到膜上離子通道調(diào)控，也與信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路的異常活化是調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮與舒張的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[24]。研究表明，P13K/AKT 信號(hào)通路引起平滑肌細(xì)胞上鈣離子內(nèi)流而致血管收縮[25]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了黃芩通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑降壓的作用機(jī)制，為黃芩治療高血壓提供了一定依據(jù)。但本研究只是通過(guò)理論預(yù)測(cè)，尚缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。