徐定昌 羌 瑞 趙 瑩 許松云 時(shí)歆未 王雨秾△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室 (上海， 201203) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)理教研室

在肝臟疾病中，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病在我國(guó)位居第二，NAFLD常合并有肥胖、高脂血癥、糖尿病等[1]。糖尿病合并脂肪肝的發(fā)病一般和胰島素抵抗有關(guān)[2]，脂肪組織胰島素抵抗會(huì)加重脂代謝異常[3]。近來有研究顯示腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與糖代謝和脂代謝關(guān)系密切，其中厚壁菌門和擬桿菌門占絕大多數(shù)[4]。腸道菌群可與人體共同或單獨(dú)代謝中藥成分，中藥成分亦可以調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[5]。目前活血祛濕藥對(duì)腸道菌群的影響情況及其與機(jī)體代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)性并不清楚。本文通過對(duì)活血藥和祛濕藥分組實(shí)驗(yàn)，以期明確活血祛濕藥對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響和相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重140～160 g，于維通利華公司購(gòu)買，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2014-0008〕，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查(倫理編號(hào)：PZSHUTCM190614013)，自由進(jìn)食飲水，12 h明暗交替照明，適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物制備 丹參、荷葉各0.3 kg，土茯苓、徐長(zhǎng)卿、絞股藍(lán)各0.7 kg，蜜麩炒蒼術(shù)0.2 kg，以上藥物均由上?？禈蛑兴庯嬈咎峁?批號(hào)分別為：180807、180615、180825、180516、180804、180906)。將中藥分為活血藥(丹參、荷葉、絞股藍(lán))、祛濕藥(土茯苓、徐長(zhǎng)卿、炒蒼術(shù))、全方藥(丹參、荷葉、絞股藍(lán)、土茯苓、徐長(zhǎng)卿、炒蒼術(shù))，制作水煎液。鹽酸二甲雙胍片，北京京豐制藥集團(tuán)生產(chǎn)(批號(hào)：180133，規(guī)格：0.25 g/片)。

1.3 儀器與試劑 熒光定量PCR儀(FTC-3000，美國(guó)安捷倫公司)，全自動(dòng)生化儀(AU5800，貝克曼公司)，血糖儀(卓越金采，批號(hào)：200637，羅氏公司)，血糖試紙(批號(hào)：476746，羅氏公司)。鏈脲佐菌素(STZ)于Sigma公司購(gòu)買(批號(hào)：WXBC6558V，規(guī)格：1 g，純度：98%)。

1.4 分組與造模 60只大鼠隨機(jī)平均分為6組(空白組、模型組、對(duì)照組、活血組、祛濕組、全方組)。除空白組大鼠外，其余5組大鼠均行糖尿病性脂肪肝造模：通過兩次腹腔注射較低劑量1%STZ溶液，誘導(dǎo)大鼠形成2型糖尿病。配置1%STZ溶液，依照體重計(jì)算注射量，腹腔注射，終濃度為30 mg/kg。于STZ注射后的第6天第2次給藥，并隔天取大鼠尾尖血檢測(cè)血糖。血糖大于16.7 mmol/L表明造模成功。

1.5 給藥方法 對(duì)照組大鼠給予二甲雙胍粉末混懸液灌胃，給藥量為6.67 ml/kg·d，給藥濃度為7.5 mg/ml。分別制備為濃度0.35、0.40、0.75 g/ml的活血藥、祛濕藥、活血祛濕藥水煎液，分別按9.43、9.75、4.40 ml/(kg·d)劑量給活血組、袪濕組、全方組大鼠灌胃，持續(xù)7周。

1.6 觀察指標(biāo) 觀察大鼠行為、狀態(tài)及死亡情況；稱量體重；觀察肝臟形態(tài)；第48天，將大鼠置于代謝籠中，收集糞便，于-80℃冰箱保存，待GC-MS檢測(cè)腸道菌群及短鏈脂肪酸；第49天，取腹主動(dòng)脈血。

1.7 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) ①采用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化儀檢測(cè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。②實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)厚壁菌、擬桿菌：采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 對(duì)樣本進(jìn)行基因組抽提，提取質(zhì)粒用Axygen plasmid miniprep Kit(Axygen公司)試劑盒，測(cè)定質(zhì)粒濃度用Qubit 3.0(Life Biotech公司)。通過熒光定量方法對(duì)厚壁菌與擬桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。所用引物及引物序列：厚壁菌928-Firm TGAAACTYAAAGGAATTGACG；1040FirmR ACCATGCACCACCTGTC。擬桿菌798cfbF CRAACAGGATTAGATACCCT；cfb967R GGTAAGGTTCCTCGCGTAT。qPCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司)。③GC-MS定量檢測(cè)短鏈脂肪酸實(shí)驗(yàn)：取糞便100 mg，加100 μl 15%磷酸，再加50 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)(異己酸)溶液100 μl和乙醚400 μl勻漿1 min，于4 ℃ 12 000 rpm 離心10 min，取上清液上機(jī)測(cè)試。GC-MS 檢測(cè)的頂空條件、氣相色譜條件、質(zhì)譜條件等參數(shù)參照參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重情況 見圖1。在造模的第12天到第26天，全方組大鼠與模型組、對(duì)照組相比，體重增長(zhǎng)速度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017、0.025)。

圖1 各組大鼠體重圖

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見圖2。全方組大鼠ALT水平高于空白組大鼠，P=0.004；活血組大鼠AST水平高于空白組、模型組和對(duì)照組，P<0.05；全方組大鼠TG水平低于對(duì)照組，P=0.014 ；造模后各組大鼠TC與LDL水平均升高，P<0.05；全方組大鼠HDL水平較其余各組升高，且與祛濕組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.045。

2.3 各組大鼠腸道菌群豐度檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠擬桿菌含量低于模型組大鼠，P=0.029；祛濕組大鼠擬桿菌含量高于對(duì)照組大鼠，P=0.014。各組厚壁菌含量無顯著差異，P>0.05。

2.4 各組大鼠菌群豐度與代謝產(chǎn)物及生化指標(biāo)的相關(guān)性 見圖4。空白組大鼠中兩種腸道菌與異戊酸都呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.01)，與乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸呈正相關(guān)(r>0,P<0.01)。模型組大鼠TC與HDL和LDL均呈正相關(guān)(r值分別為0.736和0.967,P<0.05)；厚壁菌與乙酸、丙酸、丁酸、戊酸呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.01)，與異丁酸、異戊酸、己酸呈正相關(guān)(r>0,P<0.01)；擬桿菌與厚壁菌呈負(fù)相關(guān)(r=-0.949,P<0.01)。對(duì)照組大鼠兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸呈正相關(guān)(r>0,P<0.01)，TC與兩種腸道菌及LDL均呈正相關(guān)(r>0,P<0.01)。

圖2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(n=10)

圖3 各組大鼠腸道菌群豐度檢測(cè)結(jié)果(n=6)

圖4 各組大鼠菌群豐度與代謝產(chǎn)物及生化指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

Hernández等[7]研究表明，結(jié)腸內(nèi)代謝發(fā)酵的醋酸，對(duì)體重控制和體內(nèi)乳糖穩(wěn)態(tài)以及胰島素敏感性有較好的促進(jìn)作用，丙酸是擬桿菌門發(fā)酵的主要產(chǎn)物，吸收后主要由肝臟代謝，并抑制膽固醇的合成[8]。丁酸可改善高脂飲食引起的體脂率升高和胰島素抵抗[9]。肥胖小鼠擬桿菌門數(shù)量減少，厚壁菌門數(shù)量增加[10]。這些研究表明腸道菌群和短鏈脂肪酸之間、短鏈脂肪酸和脂代謝之間存在密切聯(lián)系。因此我們測(cè)定了各組大鼠血清指標(biāo)及腸道菌群豐度并進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組大鼠血清TC與LDL濃度升高，且兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸相關(guān)性分布較空白組發(fā)生變化，表明造模使其短鏈脂肪酸及脂質(zhì)代謝發(fā)生了異常。對(duì)照組大鼠兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸的相關(guān)性分布接近空白組，且與TC表現(xiàn)出正相關(guān)。這與我們推測(cè)相符，提示藥物對(duì)于糖尿病性脂肪肝的改善作用可能通過改變擬桿菌和厚壁菌與短鏈脂肪酸的代謝關(guān)系從而影響TC代謝，達(dá)到治療目的。但這種通路的靶點(diǎn)位置有待進(jìn)一步研究。

糖尿病性脂肪肝在中醫(yī)學(xué)中散見于“消渴”“積聚”“肝著”“脾癉”等病證中[11]。臨床多見患者屬痰瘀互結(jié)證、痰濕內(nèi)阻證、肝郁氣滯證等證型[12]。其病機(jī)為脾胃運(yùn)化失常，水濕內(nèi)停，痰濕氣阻，濕阻氣機(jī)，日久阻礙血行，瘀在脅肋，形成本虛標(biāo)實(shí)之證[13]?！端貑枴て娌≌摗分刑岬健爸沃蕴m，除陳氣也”為脾癉的治療原則，即可以使用芳香化濕、健脾化濕、清利濕熱之品[14]。臨床上常用丹參、荷葉、絞股藍(lán)活血化瘀，其中荷葉、絞股藍(lán)對(duì)肥胖癥、高脂血癥具有良好的預(yù)防和治療的

作用[15]。劉君穎等[16]研究表明化痰祛濕活血方具有減輕肝細(xì)胞脂肪沉積的作用。蒼術(shù)、徐長(zhǎng)卿、土茯苓祛濕，柴胡、郁金、決明子、砂仁疏肝健脾。為明確活血祛濕中藥對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響。我們測(cè)定了各組大鼠擬桿菌和厚壁菌豐度并進(jìn)行比較，結(jié)果表明祛濕組大鼠擬桿菌豐度明顯高于對(duì)照組，而厚壁菌在各組大鼠間無明顯差異；全方組大鼠TG水平低于對(duì)照組；第2周至第4周全方組與對(duì)照組相比，體重增長(zhǎng)速度顯著下降。提示活血祛濕藥在提高擬桿菌豐度及降低TG含量上優(yōu)于二甲雙胍，這對(duì)于中藥聯(lián)合西藥治療糖尿病性脂肪肝，有較好的發(fā)掘前景。