曾繼莎，屈 敏，劉紅英

方便、快速早期診斷是提高食管鱗狀細(xì)胞癌患者治療效果、改善其預(yù)后的重要措施。腫瘤標(biāo)志物是最為普遍的腫瘤輔助診斷手段[1]，但需要根據(jù)腫瘤類型選擇合適標(biāo)志物，而目前臨床關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌尚缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物。近年有研究報(bào)道，除常見的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen， CEA)和腫瘤生長(zhǎng)因子(tumor growth factor， TGF)等腫瘤標(biāo)志物可以用于腫瘤早期診斷外，還有腫瘤基因p53抗體和微小RNA-451(microRNA-451， miR-451)等[2-3]。miR-451在診斷食管癌方面有重要價(jià)值，以往研究多通過分析組織中miR-451水平對(duì)食管癌進(jìn)行診斷，但事實(shí)上miR-451在血清中能以游離形式長(zhǎng)期存在[4]。因此，本研究探討血清p53抗體、miR-451及CEA在食管鱗狀細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期為食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月—2020年1月攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院收治的符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的食管鱗狀細(xì)胞癌89例作為觀察組，其中男72例，女17例；年齡39～76(61.52±9.36)歲；病程1～12(3.52±1.06)個(gè)月；TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期42例，Ⅲ期38例；分化程度：高分化24例，中分化45例，低分化20例；腫瘤直徑：>3 cm 50例，≤3 cm 39例。另選取同期在該院進(jìn)行體檢的健康體檢者89例作為對(duì)照組，其中男69例，女20例；年齡38～77(61.79±9.53)歲。兩組性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意；所有研究對(duì)象和(或)其家屬均知情同意，并簽署相關(guān)知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《食管癌規(guī)范化診治指南》第2版[5]中食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診；②具有食管癌手術(shù)指征，術(shù)前未進(jìn)行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②食管腺癌者；③合并其他嚴(yán)重胃和食管疾病者；④心、肝、腎和腦等重要器官嚴(yán)重疾病者；⑤不能正常溝通交流者。

1.3研究方法

1.3.1血清標(biāo)本采集：采集觀察組術(shù)前和對(duì)照組體檢日清晨空腹靜脈血10 ml，離心機(jī)12 000 r/min高速離心5 min，取上清液，保存于-80℃的冰箱中待用。

1.3.2血清p53抗體水平檢測(cè)：取受檢者血清標(biāo)本3 ml，送至中洪博元生物技術(shù)有限公司檢測(cè)血清p53抗體水平，檢測(cè)藥劑(南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn))和酶標(biāo)儀(Olympus， AU600)等均為同一批，檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

1.3.3血清miR-451水平檢測(cè)：①提取總RNA：取受檢者血清標(biāo)本3 ml，采用miR-451試劑盒(美國(guó) Invitrogen 公司生產(chǎn))提取總RNA，嚴(yán)格遵循miR-451試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。RNA經(jīng)UV1902PC紫外可見分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))測(cè)定顯示吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280在1.7～2.0，提示RNA提取成功。②RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó) Invitrogen 公司生產(chǎn))使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴(yán)格遵循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。③實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)擴(kuò)增：以cDNA為模板，以微小RNA內(nèi)參引物(U6)為內(nèi)參照，應(yīng)用Tanman universal mmixⅡ試劑盒(上海北諾生物科技有限公司生產(chǎn))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 15 s變性，50℃ 12 min退火，60℃ 1 min延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。miR-451相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4血清CEA水平檢測(cè)：取受檢者血清標(biāo)本3 ml，應(yīng)用CEA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(美國(guó)R&D公司生產(chǎn))和酶標(biāo)儀(鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)，Phomo)檢測(cè)血清CEA水平。

2 結(jié)果

2.1觀察組和對(duì)照組血清p53抗體、miR-451和CEA水平比較 觀察組血清p53抗體、miR-451和CEA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌患者和健康體檢者血清p53抗體、微小RNA-451和癌胚抗原水平比較

2.2食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清p53抗體、miR-451與CEA Spearman相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清p53抗體、miR-451與CEA均呈正相關(guān)(r=0.711、P<0.001;r=0.719，P<0.001)，見圖1和2。

2.3血清p53抗體、miR-451、CEA及3項(xiàng)聯(lián)合對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清p53抗體、miR-451、CEA及3項(xiàng)聯(lián)合診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的曲線下面積(AUC)分別為0.953、0.894、0.819、0.966，說(shuō)明對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值血清p53抗體、miR-451和CEA 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)略高于單獨(dú)檢測(cè)；血清p53抗體、miR-451、CEA及3項(xiàng)聯(lián)合診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.225、1.385、10.830 ng/ml和0.538，此時(shí)其敏感度和特異度分別為96.6%、84.3%，60.7%、100.0%，50.6%、100.0%和89.9%、88.8%。見圖3和表2。

圖3 血清p53抗體、微小RNA-451、癌胚抗原及3項(xiàng)聯(lián)合對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值的受試者工作特征曲線

3 討論

食管癌是我國(guó)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生與基因、飲食和環(huán)境等都有關(guān)，在我國(guó)90%以上的食管癌患者為食管鱗狀細(xì)胞癌，且呈現(xiàn)一定地域差異[6]。有臨床研究顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后與治療時(shí)間有關(guān)，越早期治療，預(yù)后越好，但食管鱗狀細(xì)胞癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，嚴(yán)重影響預(yù)后[7]。因此，盡早對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行診斷，有利于提高治療效果和改善預(yù)后。

表2 血清p53抗體、微小RNA-451、癌胚抗原及3項(xiàng)聯(lián)合對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值的受試者工作特征曲線分析結(jié)果

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，除采用腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷外，不同腫瘤類型可利用一些其他標(biāo)志物進(jìn)行診斷[8]。CEA是廣泛應(yīng)用于食管鱗狀細(xì)胞癌診斷的腫瘤標(biāo)志物，但敏感度和特異度較低[9-10]。隨著臨床對(duì)癌癥診斷的進(jìn)一步研究，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為要提高癌癥診斷敏感度和特異度，不能僅依靠單一指標(biāo)，而應(yīng)該采用多種指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)[11-12]。p53抗體是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)突變型p53蛋白產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，而突變型p53蛋白是由p53基因突變產(chǎn)生的蛋白。正常情況下，p53基因?yàn)槿梭w抑癌基因，能夠使癌細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防癌變，同時(shí)還可促進(jìn)缺陷細(xì)胞基因修復(fù)，但當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，失去抑癌等正常作用，且會(huì)由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┗騕13]。說(shuō)明p53抗體與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，其水平越高可能癌變?cè)絿?yán)重。有研究顯示，p53抗體在肺癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等惡性腫瘤中均呈現(xiàn)不同程度高表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清p53抗體水平高于對(duì)照組，說(shuō)明p53抗體在食管鱗狀細(xì)胞癌患者中高表達(dá)。分析其原因可能為食管鱗狀細(xì)胞癌患者在致癌因素刺激下，多種前癌基因激活，抑癌基因失活，其中p53基因易在此期間發(fā)生突變，而突變p53基因不僅不能正常發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定和抑制腫瘤血管等作用，還可轉(zhuǎn)化為促癌基因，加快癌細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，從而導(dǎo)致血清p53抗體水平升高[15]。

微小RNA為具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在個(gè)體中恒定存在。近年有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA的表達(dá)與多種癌癥有關(guān)，可起到類似促癌基因和抑癌基因的作用，但微小RNA具體起何種作用還取決于其下游的靶信使RNA的表達(dá)[16]。miR-451屬于多功能微小RNA，能參與多種細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程，miR-451能與靶信使RNA結(jié)合，抑制信使RNA翻譯，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)促癌因子生成，同時(shí)能促進(jìn)癌細(xì)胞釋放，增加血管內(nèi)皮通透性，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖[17]。趙偉和王有禮[18]報(bào)道顯示，miR-451在胃癌組織中高表達(dá)；邢艷麗[4]在關(guān)于miR-451的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-451在食管癌患者血清中高表達(dá)，且對(duì)食管癌的診斷價(jià)值較高。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-451水平高于對(duì)照組，與上述報(bào)道結(jié)果類似。本研究Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清p53抗體、miR-451與CEA均呈正相關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清p53抗體、miR-451、CEA及3項(xiàng)聯(lián)合診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的AUC分別為0.953、0.894、0.819、0.966，說(shuō)明對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值血清p53抗體、miR-451和CEA 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)略高于單獨(dú)檢測(cè)；血清p53抗體、miR-451、CEA及3項(xiàng)聯(lián)合診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.225、1.385、10.830 ng/ml和0.538，此時(shí)其敏感度和特異度分別為96.6%、84.3%，60.7%、100.0%，50.6%、100.0%和89.9%、88.8%。上述結(jié)果說(shuō)明血清p53抗體和miR-451可成為食管鱗狀細(xì)胞癌新的腫瘤標(biāo)志物，且血清p53抗體、miR-451和CEA 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值。

綜上所述，食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清p53抗體、miR-451和CEA水平升高，血清p53抗體、miR-451與CEA均呈正相關(guān)，對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌診斷價(jià)值血清p53抗體、miR-451和CEA 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)略高于單獨(dú)檢測(cè)。然而，本研究也存在一定局限性，主要在于未對(duì)p53抗體、miR-451與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的關(guān)系進(jìn)行分析，仍需后期進(jìn)一步探究。