楊 雪，姚曉華*，吳昆侖，姚有華，遲德釗*

( 1.青海大學，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學院/青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016)

【研究意義】青稞(Hordeumvulgarevar.coelesteL.)是青藏高原上的優(yōu)勢特色農(nóng)作物之一，屬于禾本科小麥族大麥屬，是大麥的變種，因其內外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥[1]。青稞具有加工食用，飼養(yǎng)牲畜，釀造青稞酒及藥用等多種用途[2]，因其籽粒含有較高蛋白質、高纖維、高維生素 和較低的糖和脂肪(俗稱三高兩低)，得到了人們的關注[3]。在海拔4200 m以上高寒地帶，青稞是唯一能正常成熟的谷物[4]。在該種植區(qū)域由于連年種植，沒有進行輪作，導致大面積發(fā)生條紋病[5]?！厩叭搜芯窟M展】條紋病是大麥生產(chǎn)的一種主要的種傳病害，主要由麥類核腔菌Pyrenophoragraminea(無性態(tài)Drechsleragraminea)引起的，屬于真菌性病害[6]。條紋病具有存活時間久、危害重、分布范圍廣、傳播途徑多、難防治特點[7]，隨著感病等級的增加，谷物產(chǎn)量，分蘗數(shù)，粒重和物生物量都減少[8]，嚴重地影響了大麥的產(chǎn)量和品質[9]。條紋病在大麥種植國家及地區(qū)害普遍發(fā)生[10]；在我國，青稞發(fā)病較嚴重地區(qū)的死亡率可達30 %～40 %[11]。目前青稞條紋病的研究主要集中在發(fā)生和防治方向[12]，對青稞條紋病發(fā)生的生理機制的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用高抗病青稞品種“昆侖14號”，高感青稞品種“Z1141”為試驗材料，通過檢測條紋病侵染的程中主要生理生化指標的變化，揭示不同抗病青稞品種對條紋病生理響應的差異。【擬解決的關鍵問題】此研究不僅有助于了解青稞條紋病發(fā)生的生理機制，而且能為抗病資源的利用和培育抗病新品種奠定生理基礎。

1 材料與方法

1.1 材料處理

抗病青稞品種的“昆侖14號”和感病青稞品種“Z1141”，由青海大學農(nóng)林科學院作物栽培與育種研究所青稞研究室繁育保存。2019年4月在青海省青稞遺傳育種重點實驗室對2品種的各500粒種子進行條紋病菌接種處理，同時設置不接種對照處理。后將2品種按“Z1141”對照、“Z1141”接種、 “昆侖14號”對照和“昆侖14號”接種順序條播，每處理種植5行，每行播種100粒，行長2 m，田間管理同大田。待兩接種品種發(fā)病15 d后(發(fā)病初期)開始分別在4個處理中取“Z1141”對照處理的葉片(Z1141C)、“Z1141”接種處理的葉片(Z1141T)、“昆侖14號”對照處理的葉片(KL14C)和“昆侖14號”接種處理的葉片(KL14T)樣品用于生理指標測定，每個樣品至少3個生物學重復。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 嚴重度 利用籽粒、針葉圖像分析系統(tǒng)(REGRNT INSTRUMENTS INC)掃描并計算青稞葉片發(fā)病面積，并以不同抗性青稞品種的葉片感病面積占總面積的比例來表示發(fā)病嚴重度。

1.2.2 可溶性蛋白 利用生產(chǎn)的總蛋白定量試劑盒S045-3-2(南京建成生物工程研究所)測定。

總蛋白濃度(μg/mL)=測定(OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(563 g/mL)×測定前稀釋倍數(shù)

1.2.3 相對電導率 葉片的相對電導率參照譚常(1985)的測定方法測定[13]。

相對電導率=(浸泡電導率值/煮沸后電導率值)×100 %

1.2.4 脯氨酸 利用脯氨酸試劑盒A107-1-1(南京建成生物工程研究所)測定。

脯氨酸含量(μg/g組織濕重)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(5 μg/mL)/勻漿液濃度(g組織濕重/mL)×樣本測試前稀釋倍數(shù)

1.2.5 丙二醛 利用植物丙二醛試劑盒A003-3-1(南京建成生物工程研究所)測定。

丙二醛含量(nmol/g)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/mL)/ 樣本濃度(g/mL)

1.2.6 相對葉綠素含量 相對葉綠素含量利用SPAD-502在發(fā)病后(約播種后30 d)上午11：00-12：00進行測定，每5 d測1次，每葉片取上、中、下3個點分別測定1次，后取其平均值。

1.2.7 葉綠素熒光參數(shù) 葉綠素熒光參數(shù)測定前葉片充分暗適應30 min，利用Technologica cf Imager system(飽和脈沖光1000 μmol/m2/s、照射時間15 min)測定葉綠素熒光參數(shù)。相關熒光參數(shù)如下所示：PSII潛在量子效率：Fv/Fm、光下開放的PSII反應中心的激發(fā)能捕獲效率：Fv′/Fm′、作用光存在時PSII實際的光化學量子效率：Fq′/Fm′，光化學淬滅系數(shù)：Fq′/Fv′，非光化學淬滅系數(shù)：NPQ。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin8.0繪制圖表、Stst2與Spss13進行方差分析和多重比較分析(Duncan’s)。

2 結果與分析

2.1 條紋病對不同抗性青稞品種嚴重度的影響

由圖1可知，不同品種的葉片感病程度不同，“昆侖14號”的病葉產(chǎn)生淡黃色細長條紋或斷續(xù)相連的條紋，而“Z1141”的病葉中間和邊緣出現(xiàn)黃褐色條紋，褐色發(fā)病部位的部分葉片干枯。可見，感病品種“Z1141”發(fā)病嚴重度顯著高于抗病品種“昆侖14號”。

2.2 條紋病對不同抗性青稞品種葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是作物生長發(fā)育必不可少的成分，而且參與植物的滲透調節(jié)，因此可溶性蛋白含量可以作為一項生理指標來反映植物生長過程中的抗逆作用[14]。由圖2可知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片可溶性蛋白質含量發(fā)生了不同的變化，其中抗病品種“昆侖14號”可溶性蛋白的含量比對照組葉片高19.35 %，兩者差異顯著(P<0.05)，而感病品種“Z1141”可溶性蛋白的含量比對照組葉片低37.13 %，兩者差異顯著(P<0.05)?？梢娙~片可溶性蛋白在青稞條紋病發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

2.3 條紋病對不同抗性青稞品種葉片相對電導率的影響

相對電導率能反映植物在逆境下細胞膜的破損程度，可以作為一項生理指標來顯示植物的抗病性[15]。由圖3可知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后相對電導率變化發(fā)生了不同程度的升高，其中“昆侖14號”的相對電導率比對照組葉片高28.06 %，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”相對電導率比對照組葉片高94.48 %，兩者差異顯著(P<0.05)。以上結果可知，在條紋病脅迫下，“Z1141”葉片相對電導率上升的幅度顯著高于“昆侖14號”(P<0.05)。由此可見，葉片相對電導率在青稞條紋病發(fā)生過程中也發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

2.4 條紋病對不同抗性青稞品種葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是組成蛋白的成分之一，調節(jié)植物細胞滲透勢，維持滲透平衡，可以對條紋病脅迫作出響應[16]。由圖4所知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后脯氨酸的含量產(chǎn)生了不同程度的升高，其中“昆侖14號”脯氨酸含量是對照組葉片的7.6倍，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”脯氨酸含量是對照組葉片的10.8倍，兩者差異顯著(P<0.05)。同時， “Z1141”處理組脯氨酸含量顯著高于“昆侖14號”(P<0.05)。由此可見，葉片脯氨酸含量在青稞條紋病發(fā)生過程中也發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

2.5 條紋病對不同抗性青稞品種葉片丙二醛含量的影響

丙二醛可以反映植物遭受逆境對膜和細胞傷害的程度，可以作為抗性指標來分析細胞受到脅迫的嚴重程度[17]。由圖5所知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后丙二醛含量均呈現(xiàn)上升趨勢，其中“昆侖14號”丙二醛含量比對照組葉片高27.45 %，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”丙二醛含量比對照組葉片高78.07 %，兩者差異顯著(P<0.05)。同時，“Z1141”丙二醛含量顯著高于“昆侖14號”。由此可見，葉片丙二醛含量在青稞條紋病發(fā)生過程中也發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

2.6 條紋病對不同抗性青稞品種葉片葉綠素熒光特性的影響

植物葉片對光能的吸收和利用可以用葉綠素熒光特性來評價[18]。由圖6可知。感病品種和抗病品種條紋病發(fā)生后對葉片熒光參數(shù)產(chǎn)生了不同的影響，其中“昆侖14號”和“Z1141”的Fv/Fm分別下降了2.64 %和48.57 %；NPQ分別降低了1 %和26.70 %，F(xiàn)'q/F'v分別降低20.28 % 和 22.06 %，“昆侖14號”的F'v/F'm顯著增加了11.21 %，而“Z1141”的F'v/F'm降低了12.46 %；“昆侖14號”和“Z1141”的F'q/Fm分別減少6.92 %和8 %。由此可見，條紋病發(fā)生時，“Z1141”比“昆侖14號”對條紋病反應更敏感。

2.7 條紋病對不同抗性青稞品種葉綠素含量的影響

由圖7可知，條紋病對不同抗性的青稞葉片的葉綠素含量產(chǎn)生了不同的影響，其中 “昆侖14號”未接種處理的葉綠素含量呈逐漸降低的趨勢， 6月6日比5月25日降了10.16 %，而“Z1141”葉綠素總含量呈逐漸增加的趨勢，6月6日比5月25日增加了5.77 %。接種處理的兩品種的葉綠素總含量隨著青稞的生長發(fā)育均呈逐漸降低的趨勢，與對照組相比，6月6日“昆侖14號”葉綠素含量降低了63.79 %，而“Z1141”降低了82.91 %，“Z1141”葉綠素含量下降的值顯著高于“昆侖14號”(P<0.05)。由此可見，條紋病對葉綠素總含量影響較大。

3 討 論

植物受病原物侵染后，體內會產(chǎn)生一系列的生理代謝變化，如蛋白質、酶、葉綠素、熒光、氨基酸等的含量都會發(fā)生變化，而這些變化與植物抗病性密切相關[19]。本研究結果表明，條紋病對不同抗性青稞品種葉片生理特性的影響不同。條紋病發(fā)生后，抗病品種的葉片可溶性蛋白含量顯著增高，而感病品種的可溶性蛋白的含量顯著降低，原因可能是當條紋病發(fā)生初期，某些抗病相關蛋白大量表達，增強了葉片的滲透調節(jié)能力，從而提高其抗病性[20]；而感病品種的葉片可溶性蛋白自我調控能力差，病原菌的入侵直接影響蛋白質的合成，同時蛋白質降解速度加快，導致葉片的蛋白質含量下降。這一結果與郭陞垚等[21]研究的結果相似。

植物遭受逆境脅迫時，由于環(huán)境中滲透勢低，往往造成植物吸水困難。為了減少傷害，植物本身會合成一些可溶性物質如脯氨酸來降低細胞滲透勢，利于從外界吸收水分[22]。本研究結果表明，“昆侖14號”和“Z1141”感病后脯氨酸含量均顯著增加，“Z1141”顯著高于“昆侖14號”，可能是脅迫初期，“昆侖14號”對條紋病忍耐程度較強，表型上受脅迫較輕，細胞功能較為正常，產(chǎn)生的脯氨酸含量與“Z1141”相比也較低。這一研究結果與魏崍等[17]對大豆的腐霉根腐病研究結果并不一致，他們的研究結果表明，在病害的脅迫下，抗病品種的脯氨酸含量增加量顯著高于感病品種，可能是品種抗性不同或病害強度不同等。另有研究表明，病害脅迫下引發(fā)植物膜脂過氧化，嚴重損傷了膜結構，導致胞內物質外滲，外滲率(相對電導率)和MDA含量的高低可以反映植物膜的傷害程度[23]。本實驗結果表明，接菌后，2品種電導率、丙二醛含量顯著增加，“昆侖14號”增加幅度顯著低于“Z1141”，說明感病品種的細胞膜功能受到嚴重的損傷，而抗病品種為了響應條紋病脅迫，能及時做出應激反應，細胞膜損傷程度較輕，此結果與蛋白質和脯氨酸含量結果是一致的。

葉片作為植物響應病害最敏感的部位，其形態(tài)結構和生理變化可直接反應植物適應和抵御脅迫的能力，而葉綠素是綠色植物進行光合作用的基礎[24]。本試驗中條紋病發(fā)生后，2個品種葉片均出現(xiàn)黃色條斑，“Z1141”發(fā)病嚴重度顯著大于“昆侖14號”(圖1)；同時6月6日與5月25日相比，“昆侖14號”對照組葉片的相對葉綠素含量逐漸降低，處理組葉片的相對葉綠素含量顯著降低；而“Z1141” 對照組的相對葉綠素含量略有升高，處理組葉片相對葉綠素含量顯著降低，且“Z1141”葉綠素含量降低值顯著高于“昆侖14號”，原因可能前期是輕度病害脅迫，葉綠素通過生物合成來適應環(huán)境的脅迫，后期病原菌破壞了葉綠體的結構，葉綠素合成速度遠小于降解速度，但抗病品種降解速度稍慢于感病品種[25]。另外，逆境脅迫不但會影響植物的葉綠素合成，還會影響正常的光化學反應，PSⅡ比 PSⅠ更易受到環(huán)境脅迫的損傷，因此可用葉綠素熒光參數(shù)來反映植物的抗性作用[26]。條紋病發(fā)生后，PSII最大光化學效率Fv/Fm、光化學淬滅系數(shù)F'q/Fm、和PSII實際的光化學量子效率F'q/F'v都呈降低趨勢，且抗病品種下降幅度低于感病品種，可能是抗性品種“昆侖14號”在條紋病脅迫下PSII受到損傷程度輕于感病品種，光合電子傳遞下降速率減緩，使得最初電子受體QA氧化還原能力和光合碳同化能力維持在較高的水平[18]。PSII反應中心的激發(fā)能捕獲效率F'v/F'm在“Z1141”顯著下降，說明“Z1141”中的光能轉化率降低，光合機構積累大量過剩光能，使得光合膜發(fā)生光氧化，導致光合機構損傷，且“Z1141”的 NPQ顯著下降，說明葉片熱耗散機制嚴重受損，又積累大量的激發(fā)能，使得植物葉綠體類囊體膜和光合復合體發(fā)生了變化，進而導致植物光保護能力喪失，出現(xiàn)了如圖1中葉片感病部位的黃斑。但F'v/F'm在“昆侖14號”顯著升高，說明在脅迫下光能轉化率升高，生物合成增多，進而緩解逆境脅迫，且NPQ下降的不明顯[27-29]。可見葉綠素熒光特性在不同抗條紋病青稞品種中也產(chǎn)生了差異響應。

4 結 論

2個不同抗病性的青稞品種對條紋病脅迫產(chǎn)生了相似的響應機制，即條紋病發(fā)生時葉片出現(xiàn)黃色條斑，細胞膜透性和脯氨酸含量增加，葉片光合系統(tǒng)受損等一系列變化。不同的生理指標在抗病性不同的品種中具有獨特的調控機制，抗病性強的青稞品種從感病初期，其生理特性指標自我調控力較強，對條紋病脅迫產(chǎn)生一定的耐受力；抗病性弱的品種的生理特性指標自我調控能力則很弱，對條紋病脅迫產(chǎn)生較弱的耐受力。本研究結果為抗病資源的利用和培育抗病新品種奠定了生理基礎。要全面地了解青稞的抗條紋病機制，還需要從基因水平進行進一步的探索。