陳 越，陳 玲，鐘巧芳，張敦宇，李娥賢，王文心，王 波，王玲仙，柯 學，程在全，肖素勤*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650205；2.元江縣植保植檢站,云南 元江 653300)

【研究意義】褐飛虱(NilaparvatalugensStal)是中國乃至亞洲水稻生產(chǎn)上危害最嚴重的遷飛性害蟲之一，褐飛虱其成蟲和若蟲在取食為害水稻的同時還會傳播多種水稻病毒病，對水稻的生產(chǎn)和糧食安全產(chǎn)生極大地威脅[1]。長期以來，對褐飛虱的防治一直以噴灑殺蟲劑為主，雖然現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了很多可以替代傳統(tǒng)農(nóng)藥殺蟲劑的環(huán)境友好型綠色殺蟲劑，但長期的使用也大大地增加了水稻的生產(chǎn)成本。因此，從水稻資源中挖掘抗褐飛虱種質(zhì)進而培育、推廣抗褐飛虱水稻品種是最經(jīng)濟有效的措施，也是中國防治褐飛虱為害的重要策略。水稻的地方品種資源是由野生稻演變而來，對種植地生態(tài)條件及水稻流行性病蟲害具有較強的適應性和耐受性[2]。云南作為中國最優(yōu)異地方稻種資源的集中地，被譽為“稻之王國”，云南水稻地方品種資源蘊含很多優(yōu)異抗病抗逆基因，是中國水稻育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及科學研究中非常重要的物質(zhì)基礎，具有較高的學術和應用價值[3-4]。水稻品種的抗蟲性篩選一直都是一個研究熱點，自20世紀60年代以來，亞洲各水稻生產(chǎn)國的研究者相繼開展從水稻地方品種資源中篩選抗褐飛虱品種的工作，中國的水稻研究者也先后從四川[5]、江蘇[6]、廣東[7]、江西[8]、廣西[9]等多個省份或地區(qū)的水稻地方品種資源及水稻材料中成功地篩選到許多適應當?shù)厣鷳B(tài)條件的褐飛虱的抗性品種?！厩叭搜芯窟M展】前期的研究發(fā)現(xiàn)抗褐飛虱基因資源主要存在于秈稻和野生稻中，而在地理分布上，秈稻主要存在于溫暖氣候條件下的熱帶和亞熱帶的低緯度海拔地區(qū)，這些地區(qū)也是褐飛虱的常發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)，也就是說抗褐飛虱基因主要存在于褐飛虱頻繁發(fā)生區(qū)的秈稻品種中[7,10]。因此，探明水稻褐飛虱抗性與其秈粳分化的相關性，將有利于揭示水稻抗蟲基因的起源，也為進一步從水稻地方資源中篩選抗褐飛虱種質(zhì)提供了有利指導。隨著分子生物學和水稻基因組學的迅速發(fā)展，使得基于秈、粳稻DNA分子水平上與秈粳分化相關的差異序列而設計的InDel標記得到廣泛應用，該標記通過統(tǒng)計水稻品種在不同InDel位點上的秈粳基因頻率對其秈粳屬性進行劃分，并具有PCR帶型簡單、快速、準確、高效的特點[11]。王友林等[12]用19對InDel秈粳特異性標記準確地檢測出12個雜交稻及其親本材料的秈粳類型，并對雜交稻的雜種優(yōu)勢進行預測，結果表明InDel標記不僅可以高效準確的檢測出水稻的秈粳類型，而且在雜種優(yōu)勢預測方面也具有較大的潛力?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，已有一些研究涉及水稻秈粳分化與抗蟲性[13]、秈粳分化與病原菌致病性[14]之間的聯(lián)系的報道，但基于秈粳差異序列設計的InDel標記對水稻地方品種資源進行秈粳屬性鑒定，并分析秈粳基因頻率與褐飛虱抗性的相關性未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過田間自然種群鑒定法及39對InDel秈粳特異性標記對云南省10個地州(市)40個縣(區(qū))的176份水稻地方品種資源進行褐飛虱抗性的初篩和秈粳屬性的鑒定，并分析云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性級別與秈粳基因頻率之間的關系，以期揭示云南水稻地方品種資源不同秈粳基因型在褐飛虱抗性方面的差異，為今后進一步篩選抗褐飛虱水稻種質(zhì)及褐飛虱抗性基因的起源研究提供指導，也為利用云南水稻地方品種進行抗蟲育種時確定合適的秈粳配比、科學利用秈粳互滲提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的176份云南水稻地方品種資源來自云南省的10個地州(市)40個縣(區(qū))，均由云南省作物種質(zhì)資源庫提供，以典型粳稻日本晴和典型秈稻9311作為秈粳屬性劃分對照品種，以9311和保存于云南省玉溪市元江縣實驗基地內(nèi)的藥用野生稻分別作為感褐飛虱和抗褐飛虱的對照品種。

1.2 云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性鑒定

供試的176份云南水稻地方品種資源及9311(感褐飛虱對照)于2018年7月中旬播種在云南省玉溪市元江縣實驗基地里的藥用野生稻異位保護點內(nèi)，元江縣地處低緯度高原地區(qū)，屬季風氣候，全年氣候炎熱，每年的8-10月有大量的褐飛虱蟲源遷入，是水稻褐飛虱的常發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)[15]。采用田間自然遷入蟲源方式對云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性進行鑒定，以元江縣植保植檢站(http:// www.nyj.yuxi.gov.cn/news14277/20180919/7002711.shtml) 分布的該年褐飛虱遷入蟲量作為褐飛虱達到發(fā)生要求的依據(jù)。每份水稻地方品種資源分2行單株種植20株，行株距為20 cm×15 cm，所有資源隨機排列，設置3次重復，每10份水稻地方資源種1行感褐飛虱品種9311，每個云南地方品種資源的重復內(nèi)移栽1行抗褐飛虱對照藥用野生稻的稻樁，從播種到褐飛虱抗性調(diào)查結束期間僅防治病害，不進行任何殺蟲處理，水肥按常規(guī)稻田管理。當感蟲對照9311枯死率達到90 %時[16]參照劉光杰等[17]對褐飛虱抗性水平的評價標準(表1)，以目測法按受害程度評定云南水稻地方品種資源對褐飛虱的抗感性。

表1 水稻材料抗褐飛虱的鑒定評價標準Table 1 Evaluation standard for resistance of varieties to the brown planthopper

1.3 云南水稻地方品種資源秈粳類型的鑒定方法

1.3.1 用于秈粳分類的InDel標記的篩選 用秈粳對照材料(日本晴、9311)和分別來自不同地州(市)的10份地方稻資源從盧寶榮等[18]報道的45對InDel標記中篩選出可用于云南水稻地方品種秈粳分類的標記。在45對標記中刪除R2M24、R3M37、R5M30、R7M37、R9M10及R12M10，其余39對條帶清晰且在不同來源的10份云南水稻資源中均能擴增出與典型粳稻(日本晴)或典型秈稻(9311)條帶類型相吻合的秈-粳特異性標記，所用標記由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2 InDel標記的檢測 水稻基因組DNA提取及PCR擴增參考陳越等[5]方法，用4 %瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離，拍攝并分析電泳結果。

1.3.3 云南水稻地方品種資源的秈粳基因頻率計算與秈粳劃分標準 參照盧寶榮等[18]報道的水稻秈粳基因頻率的計算方法和公式，統(tǒng)計云南水稻地方品種資源在39個InDel秈粳特異性標記上的秈粳基因型數(shù)據(jù)，計算176份云南水稻地方品種資源的秈粳基因頻率，按照表2中的秈型、粳型基因頻率的InDel劃分標準劃分其秈粳類型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0軟件進行褐飛虱抗性級別與秈型基因頻率的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 云南水稻地方品種資源的秈粳鑒定結果

篩選出的39對InDel標記在擴增176份資源時均未出現(xiàn)空白條帶，部分資源擴增帶型見圖1。根據(jù)176份云南水稻地方品種資源在39對InDel秈粳特異標記擴增下的不同秈粳基因型，計算每份資源的秈、粳基因頻率。按照表2中的分類標準對云南水稻地方品種資源的秈粳類型進行劃分，由表2可知176份云南水稻地方品種資源中鑒定為秈稻(84份)的數(shù)量最多，占47.73 %，其次為典型秈稻(28份)、粳稻(26份)、典型粳稻(25份)分別占15.91 %、14.77 %、14.20 %，而滲入較多亞種片段的偏粳(2份)、偏秈(5份)和中間型(6份)的資源較少，3種秈粳類型僅占7.39 %。分析結果表明，云南10個州(市)40個縣(區(qū))的176份水稻地方品種資源以秈型基因頻率(0.60的秈型稻(典型秈稻、秈稻及偏秈)為主。

表2 秈型(Fi)或粳型(Fj)基因頻率的InDel分類標準及不同秈粳類型中抗褐飛虱的資源數(shù)量Table 2 InDel classification standard of indica gene frequencies or japonica gene frequencies and the number of brown planthopper resistant resources in different types of indica-japonica rice varieties in Yunnan

2.2 云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性

供試的176份云南水稻地方品種資源經(jīng)褐飛虱田間自然鑒定結果顯示(表2)，176份水稻地方品種資源被褐飛虱傷害后表現(xiàn)出的抗感水平也不盡相同，共有45份資源對褐飛虱有抗性，其中有2份資源(普洱市的安南谷和西雙版納州的老來紅)表現(xiàn)為抗，占1.14 %；43份資源表現(xiàn)為中抗，占24.43 %；而表現(xiàn)為中感、感蟲及高感的資源分別為48、36和47份，分別占供試資源的27.27 %、20.45 %、26.70 %。供試的176份云南水稻地方品種資源中以感褐飛虱的品種為主，只有少數(shù)品種資源表現(xiàn)出抗性。

2.3 云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性與秈粳基因頻率的相關性

供試的176份資源的秈型基因頻率與褐飛虱抗性級別的相關性分析呈極顯著負相關，相關系數(shù)r=-0.345，P<0.01。由表2看出，28份秈型基因頻率在0.91～1.00的典型秈稻中對褐飛虱表現(xiàn)為中抗的資源有9份，其余19份資源均無抗性；84份秈型基因頻率在0.77～0.90的秈稻資源中有2份(普洱市的安南谷(Fi=0.85)和西雙版納州的老來紅(Fi=0.87))對褐飛虱表現(xiàn)為抗蟲，有32份對褐飛虱表現(xiàn)為中抗，50份為無抗性；5份秈型基因頻率在0.62～0.71的偏秈資源中除來自臨滄市的烏咀糯(Fi=0.69)對褐飛虱表現(xiàn)為中抗，其他偏秈資源均不抗褐飛虱；6份秈型基因頻率在0.42～0.58的中間型資源及2份秈型基因頻率為0.28和0.40的偏粳資源對褐飛虱均不表現(xiàn)出抗性；26份秈型基因頻率在0.13～0.26的粳稻中除來自臨滄市的糯谷(Fi=0.13)對褐飛虱表現(xiàn)為中抗外，其他粳稻資源均不抗褐飛虱；25份秈型基因頻率≦0.1的典型粳稻資源對褐飛虱均沒有抗性。從以上數(shù)據(jù)可以看出鑒定為抗褐飛虱的45份資源中除臨滄市的糯谷(中抗)為秈型基因頻率為0.13的粳稻資源，其余44份對褐飛虱有抗性的均為秈型基因頻率在0.69～1.00的秈型稻資源，以上結果表明秈型基因頻率與褐飛虱抗性密切相關。

3 討 論

栽培稻是全球也是中國賴以生存的主要糧食作物之一，中國作為亞洲栽培稻的起源地之一具有悠久的水稻栽培歷史，在1800多年前的東漢時期就形成了“南秈北粳”的種植區(qū)劃[19]。秈稻和粳稻由于其在地理分布、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境及農(nóng)耕模式的不同，形成了在形態(tài)特征、解剖結構、細胞水平、蛋白質(zhì)水平、DNA水平上差異顯著的兩個亞種[20]。近年來，隨著比較基因組學的發(fā)展及秈稻9311和粳稻日本晴全基因組測序工作的完成，使得如SSR、RFLP、RAPD及ILP等分子生物學技術成功用于水稻秈粳類型的鑒定，其中應用最多的是針對栽培稻秈粳亞種在DNA水平上的差異而設計開發(fā)的InDel標記。盧寶榮等[18]，蔡星星等[21]，陳萍萍等[22]先后用已知秈粳屬性的水稻材料或程式指數(shù)法分別對InDel秈粳鑒定法予以驗證，證實了其在栽培稻、野生稻甚至稻屬的不同近緣種材料秈粳鑒定上的可行性、有效性及準確性。對來自云南10個地州(市)40個縣(區(qū))的水稻地方品種資源的秈粳屬性利用39對InDel秈粳特異標記進行鑒定，發(fā)現(xiàn)云南水稻地方品種資源的秈粳分化明顯，InDel分子指數(shù)法劃分的7種秈粳類型均有存在，176份材料以秈型基因頻率(0.60的秈型稻為主，其中秈稻(84份)和典型秈稻(28份)占所有品種資源的百分比較其他類型高，分別為47.73 %和15.91 %，而偏粳、偏秈及中間型資源的數(shù)量比其他類型低，僅為2、5和6份，可能是由于這些滲入大量亞種片段的秈粳類型含有較多不穩(wěn)定、不利性狀而導致在自然選擇和人工馴化過程中逐漸被淘汰，姚國新等[12]的研究也有相同的結果。

云南因其獨特的氣候、復雜的地形及多民族文化背景的差異，形成了多樣性豐富的地方稻品種，已有學者在云南地方稻中發(fā)現(xiàn)孕穗開花期耐冷性極強、抗稻瘟病、抗白葉枯病、矮稈等優(yōu)異資源，為水稻的遺傳改良提供了多樣的基因資源[3]。本研究以多樣性豐富且含有較多優(yōu)異基因的云南水稻地方品種資源為試驗材料，以田間自然遷入褐飛虱蟲源的方式對其褐飛虱抗性進行鑒定，結果表明176份云南水稻地方品種資源中有45份資源對褐飛虱具有抗性，占供試資源的25.57 %，其中來自普洱市的安南谷和西雙版納州的老來紅對褐飛虱表現(xiàn)為抗，43份表現(xiàn)為中抗，其他131資源均不抗褐飛虱。在45份抗褐飛虱的資源中除臨滄市的糯谷(Fi=0.13)為粳稻外其他資源均為秈型基因頻率>0.60的秈型稻材料。分析176份云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性級別與秈型基因頻率的相關性分析結果呈極顯著負相關(r=-0.345，P<0.01)，也就是說含有較高秈型基因頻率的資源對褐飛虱抗性強，即秈型基因頻率>0.60的秈型稻資源攜帶抗褐飛虱基因的概率高于秈型基因頻率≦0.60的資源。蘇昌潮等[2]對515份來自越南和中國(云南、貴州、廣西及太湖流域)4個地區(qū)水稻資源的褐飛虱抗性鑒定以及對褐飛虱表現(xiàn)出抗性的資源的秈粳屬性鑒定結果也有相同的結論，發(fā)現(xiàn)大部分抗褐飛虱的資源為秈稻材料。而褐飛虱抗性資源多分布于種植秈稻的熱帶或亞熱帶的低緯度海拔地區(qū)，而這些地區(qū)往往也是褐飛虱發(fā)生為害水稻的地區(qū)，Yoshihara[23]和Shigematsu[24]的研究發(fā)現(xiàn)抗褐飛虱秈稻品種中存在抑制其取食的草酸和β-谷甾醇，進一步證明了褐飛虱抗性基因主要存在于秈稻品種中。

4 結 論

InDel標記具有較強的秈粳特異性，在秈粳屬性鑒定方面具有較好的區(qū)分效果。通過對供試的176份云南水稻地方品種對褐飛虱抗性與秈粳分化的相關性分析表明，褐飛虱抗性級別與秈型基因頻率呈極顯著負相關，說明水稻的秈型基因頻率越高，對褐飛虱的抗性越強。通過田間自然鑒定法篩選出對褐飛虱表現(xiàn)出抗性的45份資源，其中2份(普洱市的安南谷和西雙版納州的老來紅)表現(xiàn)為抗的資源可作為培育抗褐飛虱品種的親本材料，以豐富云南的抗褐飛虱種質(zhì)資源。通過研究明確了云南水稻地方品種資源的褐飛虱抗性與秈粳基因頻率之間的相關性，為今后深入研究褐飛虱抗性基因的起源及抗褐飛虱資源的定向遺傳改良等方面提供了參考。