陳恩發(fā)，劉 輝，丁海兵，潘 牧，王啟富

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】研究魔芋軟腐病病原菌的致病機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步探明該病原菌的侵染過(guò)程和該病的防治提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】魔芋(Konjac)為天南星科魔芋屬多年生草本植物，在我國(guó)南部地區(qū)廣泛種植。魔芋含有豐富的葡甘聚糖，因其具有保水性、成膜性、膠凝性、乳化性、穩(wěn)定性等良好的特性，被廣泛地應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、化工、生物等領(lǐng)域[1-2]。近年來(lái)，隨著魔芋種植面積的不斷擴(kuò)大，各種病害便隨之發(fā)生，且日漸嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。魔芋軟腐病是危害魔芋生產(chǎn)的主要病害之一[3]，發(fā)病率高，死亡率大且極易傳染，常大面積、連片爆發(fā)，給魔芋產(chǎn)業(yè)帶來(lái)毀滅性打擊，極度增加了農(nóng)民的種植風(fēng)險(xiǎn)[4]。劉佩瑛等[5]研究發(fā)現(xiàn)，魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Eriwiniacarotovorapv.carotovora)侵染所致。修建華等[6]將軟腐病菌株分為3個(gè)組群，分別為菊歐文氏桿菌(Erwiniachrysanthemi,E.ch.)、胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora,E.c.c.)和一組尚不能確定的菌株。魔芋感染軟腐病菌后，葉片或塊莖變軟、倒伏、發(fā)黑腐爛，并帶有刺激的酒臭味[7]。胡蘿卜軟腐歐文氏菌致病因子主要依賴其分泌的植物細(xì)胞壁降解酶，包括果膠酶、纖維素酶、以及多種蛋白水解酶等[8]。其中，果膠酶是致病過(guò)程中的主要致病因子，果膠酶是一種以多種形式存在的同功酶，由果膠酸鹽裂解酶(pel)、果膠甲基酯酶(pme)、果膠質(zhì)裂解酶(pnl)、聚半乳糖醛酸酶等組成，有不同的基因編碼，并成簇排列。果膠酸鹽裂解酶(pel)是果膠酶中最重要的酶，由5個(gè)主要果膠裂解酶和至少3個(gè)次要果膠裂解酶組成[9]。在病原菌侵染的不同時(shí)期均有果膠酶基因的表達(dá)[10]，有研究表明，果膠酶基因通過(guò)與一些基因的協(xié)同作用，可使病原菌穿透植物組織的能力提高，加速植物細(xì)胞壁的降解，使細(xì)胞壁成分被釋放出來(lái)為病原菌提供營(yíng)養(yǎng)[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國(guó)內(nèi)對(duì)于魔芋軟腐病致病機(jī)理的研究報(bào)道較少，未見魔芋軟腐病果膠酸鹽裂解酶相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)克隆技術(shù)得到魔芋軟腐病中2個(gè)重要的果膠鹽裂解酶基因pelD和pelE，并對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)、原核表達(dá)和酶活性分析，以期獲得正常表達(dá)的pelD和pelE基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 研究采用的魔芋軟腐病病原菌菌株由課題組分離自貴州省臺(tái)江縣。

1.1.2 試劑EscherichiacoliDH5α、pET28a(+)和EscherichiacoliBL21(DE3)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、T4DNA連接酶、2×TaqPCR MasterMix、TaqDNA Polymerase、6×buffer、10×buffer、SYBR RT-PCT Kit、蛋白酶K、DLMarker 2000、DLMarker 15000、PMD-18T和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)于TaKaRa生物公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、SM0431 maker購(gòu)于Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自Tiangen公司；卡那霉素、氨芐青霉素、潮霉素B(Sangon Biotech)購(gòu)于sigma公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基：酵母浸膏 1 g、牛肉浸膏 3 g、葡萄糖 10 g、蛋白胨 5 g、瓊脂 18 g，加蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH至7.0。NA 液體培養(yǎng)基：酵母浸膏1 g、葡萄糖 10 g、牛肉浸膏 3 g、蛋白胨5 g，加蒸餾水定容至 1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加適量蒸餾水緩慢加熱使其充分溶解，用蒸餾水定容至 1000 mL，加熱混勻。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA 的提取 提取參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2pelD和pelE基因引物設(shè)計(jì) 從GenBank中下載已注冊(cè)的pelD和pelE基因同源序列，利用Primer 5 設(shè)計(jì)2個(gè)基因的擴(kuò)增引物(表1)。

表1 pelD和pelE基因擴(kuò)增引物Table 1 The amplified primers of pelD and pelE genes

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物克隆 以提取的DNA為模板，設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃(pelD)、60 ℃(pelE)退火1 min，72 ℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，12 ℃保存。電泳檢測(cè)(1 %瓊脂糖凝膠)，膠回收目的片段。將目的片段與 PMD-19T載體的連接，反應(yīng)體系10 μl：PMD-19TVector DNA 1 μl，PCR 目的片段產(chǎn)物 4 μl，Solution I 5 μl，16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落，搖床培養(yǎng)擴(kuò)繁，參考Tiangen公司的質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證，送出測(cè)序。

1.2.4pelD和pelE基因序列生物信息學(xué)分析 用DNAMAN (Virsion 6.0)軟件和Protparam軟件預(yù)測(cè)分析目的基因片段序列?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在網(wǎng)頁(yè)http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/上進(jìn)行；亞細(xì)胞定位分析在網(wǎng)頁(yè)http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/上進(jìn)行；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析在網(wǎng)頁(yè)http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html上進(jìn)行，三級(jí)結(jié)構(gòu)分析在網(wǎng)頁(yè)SWISS-MODLE (http://swissmodel.expasy.org/interactive)上進(jìn)行；利用Doolittle 算法對(duì)目的蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。

1.2.5 目的蛋白的原核表達(dá)分析 分別用相應(yīng)的酶雙酶切連有目的基因片段(pelD和pelE基因)的T-easy質(zhì)粒和pET28a載體，膠回收目的基因和載體片段，將目的基因片段和載體片段按1∶1混合，加入T4連接酶，室溫連接2～3 h，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)、菌液PCR及酶切驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)受體菌，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，置于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取上清液接種于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中(菌液上清液：LB 液體培養(yǎng)基=1∶100)培養(yǎng)，在A600下測(cè)吸光值在0.6～0.8時(shí)，加入IPTG調(diào)節(jié)終濃度為1 mmol/L，于37 ℃誘導(dǎo)反應(yīng)5 h，分別取1 mL菌液，經(jīng)超聲波破碎和離心后，將菌體沉淀用0.2 mmol/L PBS(Na2HPO4-Na2HPO4)重懸，室溫?fù)u床培養(yǎng)3 h， 4 ℃、12 000 r/min離心30 min，12 %的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)上清液，用鎳瓊脂糖親和層析法洗脫。

1.2.6 酶活性分析 超聲波處理1.2.5中誘導(dǎo)5 h及未誘導(dǎo)的菌體(功率80 %，超聲波振蕩2 s，間歇4 s，總時(shí)間為10 min,制冷)，15 000 r/min離心5 min,取上清液用于測(cè)定酶活,酶活測(cè)定參照李洋等[11]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 pelD 和 pelE 基因片段的擴(kuò)增

從圖1看出，對(duì)pelD基因和pelE基因進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增，pelD基因在 1209 bp處有一特異條帶，pelE基因在1080 bp 處有一特異條帶，均與預(yù)測(cè)條帶大小一致。

2.2 pelD 和 pelE 基因克隆至 PMD19-T 載體的鑒定

將pelD和pelE基因的目的片段經(jīng)過(guò)凝膠回收，克隆至 PMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(圖2)和提取質(zhì)粒雙酶切(圖3)，均得到與預(yù)期條帶大小相當(dāng)?shù)臈l帶。

2.3 pelD 和 pelE 基因序列測(cè)定

測(cè)序結(jié)果表明，pelD基因序列大小為1209 bp，pelE基因序列大小為1080 bp，與目的基因片段大小一致。Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因的序列與已報(bào)道的果膠酶基因pelD和pelE具有較高的同源性，且有完整的閱讀框。

2.4 pelD 和 pelE 基因的生物學(xué)信息

通過(guò)Protparam預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，pelD基因編碼一個(gè)完整的開放閱讀框，閱讀框架全長(zhǎng)為1209 bp，編碼氨基酸殘基402個(gè)，具有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。基因編碼的蛋白分子式為 C1891H2938N536O588S6，分子量為42.78 kDa，等電點(diǎn)為5.79，半衰期為30 h。不穩(wěn)定系數(shù)為22.12，為穩(wěn)定性蛋白。含39個(gè)負(fù)電荷氨基酸(Asp + Glu)，35個(gè)正電荷氨基酸(Arg + Lys)，沒有賴氨酸拉鏈，果膠酸鹽裂解酶折疊和致病因子的蛋白保守區(qū)在第94～301個(gè)氨基酸區(qū)域，在1～16 個(gè)氨基酸處存在信號(hào)肽；pelE基因含有一個(gè)完整的開放閱讀框，閱讀框架全長(zhǎng)為1080 bp，編碼氨基酸殘基359個(gè)，含有起始密碼子ATG 和終止密碼子TAA?；蚓幋a的蛋白分子式為C1891H2938N536O588S6，分子量為37.9 kDa，等電點(diǎn)為9.43，半衰期是30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為31.50，為穩(wěn)定性蛋白。帶負(fù)電荷氨基酸 (Asp + Glu)24個(gè)，正電荷氨基酸(Arg + Lys)41個(gè)，不含有賴氨酸拉鏈，果膠酸鹽裂解酶折疊和致病因子的蛋白保守區(qū)為第94～301個(gè)氨基酸區(qū)域，在1～21個(gè)氨基酸處存在信號(hào)肽。

經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，pelD蛋白無(wú)跨膜區(qū)，pelE蛋白在50～72個(gè)氨基酸處存在一跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)Protscale分析 pelD蛋白的親水/疏水性發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有165個(gè)疏水氨基酸，237個(gè)親水氨基酸，親水性氨基酸58.96 %，且在整個(gè)肽鏈中均勻分布，推測(cè)pelD蛋白為親水性蛋白。pelE蛋白含有144個(gè)疏水氨基酸，215個(gè)親水氨基酸，親水性氨基酸59.89 %，且在整個(gè)肽鏈中均勻分布，推測(cè)pelE蛋白也為親水性蛋白。對(duì)pelD蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析得出，pelD蛋白定位于線粒體的可能性為4.4 %，作為信號(hào)肽的可能性為92.2 %。pelE蛋白作為信號(hào)肽的可能性為16.8.2 %,為其他成分的可能行為87.9 %。對(duì)pelD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含α螺旋24.88 %，β轉(zhuǎn)角9.20 %，無(wú)規(guī)則卷曲39.05 %，延伸鏈26.87 %。pelE蛋白質(zhì)含α螺旋17.55 %，β轉(zhuǎn)角11.98 %，39.83 %無(wú)規(guī)則卷曲，延伸鏈30.64 %。并用 SWISS-MODLE預(yù)測(cè)得pelD 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和pelE 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)，pelD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊方式為單鏈右旋β螺旋，解析度為1.60A，扭曲值為-2.88，溶解值為-2.74，Cβ值為-1.51，Oligo-state為單體，GMQE值為0.64，QMEAN值為-3.68。pelE蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊方式為單鏈右旋β螺旋，解析度為2.10A,扭曲值為-2.91，溶解值為-1.56，Cβ值為-0.75。Oligo-state為單體，GMQE值為0.42，QMEAN值為-3.53。

2.5 目的蛋白的原核表達(dá)

對(duì)轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體 pET28a-pelD和pET28a-pelE菌株轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，SDS-PAGE 電泳分析看出(圖6)，pelD 和 pelE蛋白均在在約45 ku處出現(xiàn)明顯的條帶。

2.6 目的蛋白的酶活性

從圖7看出，誘導(dǎo)后pelD和pelE的酶活性均高于誘導(dǎo)前，pelD的酶活是誘導(dǎo)前的1.79倍，pelE是誘導(dǎo)前的1.75倍。表明，pelD及pelE基因均能正常表達(dá)，且經(jīng)誘導(dǎo)后活性均顯著上升，即研究獲得了具有正常功能的魔芋pelD和pelE基因。

3 討 論

果膠鹽裂解酶是是植物細(xì)胞壁降解酶中重要的酶類，是植物病原菌的主要致病因子，其有關(guān)克隆和分析報(bào)道較多，1995年Heikinheimo等[12]研究Ecc SCC3193中的果膠酶發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白含有信號(hào)肽且與Ecc71菌株中的pel-3編碼的蛋白相似，但與其他細(xì)菌分泌的pel蛋白差異較大。筆者等研究獲得的pelD和pelE基因與李琦等[13]的研究結(jié)果相同,均含有信號(hào)肽。Hla等[14]研究表明，不同菌株中的同一種果膠酶同源性較低，可能是由細(xì)菌本身的特殊性導(dǎo)致。研究得到的pelD和pelE基因與其他果膠酶基因同源性較高，但這一結(jié)果是否證明這2個(gè)基因在進(jìn)化上保守有待進(jìn)一步研究。

果膠酶基因是軟腐病侵染植物組織過(guò)程中的重要致病基因，作為果膠酶基因家族中的重要成員，pelD和pelE基因主要在降解植物組織細(xì)胞壁果膠物質(zhì)中發(fā)揮作用。有研究表明，作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，pelA、pelE和pelD基因?qū)ν饨绛h(huán)境條件比較敏感，pelD和pelE基因的表達(dá)受pH 的影響較大，在堿性條件下，二者的活力均較低[15]；在酸性條件下，pelD基因主要表達(dá)于病菌侵染過(guò)程的早期，而pelE基因則在正常情況下轉(zhuǎn)錄[16]。在cAMP途徑中,pelD和pelE基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受CRP蛋白的抑制，但低濃度的Fe2+有利于pelD和pelE基因的表達(dá)。本研究對(duì)魔芋軟腐病菌的pelD和pelE基因進(jìn)行克隆分析和酶活性分析獲得pelD和pelE基因的完整序列。經(jīng)原核表達(dá)分析pelD和pelE的表達(dá)產(chǎn)物均在約45 ku 處有明顯的條帶,與Dickeya[17]的研究結(jié)果較吻合，IPTG誘導(dǎo)后pelD和pelE基因的酶活性分別是誘導(dǎo)前的1.79和1.75倍。表明，研究獲得了具有正常功能的魔芋軟腐病的pelD和pelE基因。為下一步研究魔芋軟腐病菌果膠酶基因的功能提供了參考，為魔芋軟腐病軟腐病的防治提供了重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過(guò)PCR克隆技術(shù)獲得具有完整閱讀框的魔芋軟腐病pelD和pelE基因，2個(gè)基因均在約45 ku處出現(xiàn)明顯的條帶，pelD和pelE誘導(dǎo)后酶活分別是誘導(dǎo)前的1.79和1.75倍，2個(gè)基因具有正常功能。