孫莉莎，郭 銘，司二靜，姚立蓉，汪軍成， 李葆春，楊 軻，孟亞雄，馬小樂(lè)，王化俊

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

大麥(HordeumvulgareL.)屬于禾本科一年生植物，是最早被馴化的作物之一。由于其具有早熟、耐鹽、耐旱和耐貧瘠等特性，在世界各地均有種植，在中國(guó)已種植了數(shù)千年[1]。在世界耕作谷物中，大麥的種植總面積和產(chǎn)量位居第四，僅次于小麥、水稻和玉米；中國(guó)的大麥現(xiàn)多種植于淮河流域及其以北地區(qū)[2]。

大麥條紋病(barley leaf stripe )是由大麥條紋病菌Pyrenophoragraminea(anamorph Drechslea graminea)[(Rabenh.ex.Schlech.)Shoemaker]引起的以種子帶菌為初侵染源的系統(tǒng)性病害[3]。大多數(shù)大麥種植都是自留種，受病菌侵染嚴(yán)重，雖然新品種在推廣種植初期發(fā)病較輕，但隨著種植年限增加，發(fā)病會(huì)逐漸嚴(yán)重[4]。大麥條紋病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，甘肅省是在中國(guó)發(fā)病的主要地區(qū)之一[5]。Arabi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大麥條紋病菌毒性受1對(duì)顯性基因控制。大麥條紋病菌屬于植物病原真菌，其產(chǎn)生的毒素原初作用位點(diǎn)可能在寄主的細(xì)胞質(zhì)膜上[7]，這些毒素先破壞細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)，使電解質(zhì)滲漏增加，從而達(dá)到對(duì)寄主的破壞作用。影響病原菌致病力的因素主要有致病因子類型及其活性，酶、毒素、激素是病原菌的三大致病因子，病原菌產(chǎn)生的毒素或病原菌與寄主協(xié)同作用產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以引起植物萎蔫并表現(xiàn)出組織壞死等癥狀[8]。研究發(fā)現(xiàn)，用病原菌毒素處理材料,可以快速篩選出抗病材料[9]，這對(duì)植物的抗性鑒定及抗病育種有重要的意義。馬瑩瑩等[10]研究表明，玉米在接種玉蜀黍尾孢菌毒素后，其葉片中防御酶活性升高，且在7 h時(shí)達(dá)到峰值，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量降低。吳穎靜等[11]研究表明，擬南芥被大麗輪枝菌侵染后，其胼胝質(zhì)、活性氧含量和防御酶活性均升高。但關(guān)于大麥條紋病菌毒素與大麥生長(zhǎng)及其防御酶活性關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究擬以20個(gè)大麥品種為供試材料，研究大麥條紋病菌毒素對(duì)大麥萌發(fā)、胚根和胚芽生長(zhǎng)的影響，并對(duì)篩選出的強(qiáng)抗病性品種進(jìn)行毒素脅迫下防御酶活性變化的研究，確定毒素脅迫處理的最適時(shí)間，篩選衡量大麥條紋病菌抗性水平的防御酶指標(biāo)，以便在室內(nèi)完成對(duì)大麥抗性品種的初步篩選及鑒定，為大麥條紋病菌抗性機(jī)制的研究和抗性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大麥條紋病菌菌株QWC為強(qiáng)致病力型菌株[12]。供試大麥材料詳見(jiàn)表1，均由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麥類種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。

表1 供試大麥品種及品系Table 1 Barley varieties(lines) tested

1.2 方法

1.2.1 改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備

9 g蔗糖、5 g酒石酸銨、1 g NH4NO3、1 g K2HPO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.1 g NaCl、 0.13 g CaCl2·2H2O、18.3 mg FeSO4·7H2O、3.5 mg ZnSO4·7H2O、2 mg MnCl2·4H2O，蒸餾水定容至1 L。

1.2.2 大麥條紋病菌毒素液的制備

將低溫保存的QWC菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，22 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，沿菌餅邊緣打直徑10 mm的菌餅，置于200 mL改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d；培養(yǎng)液經(jīng)無(wú)菌濾紙過(guò)濾后得到含QWC菌株代謝物的濾液。

1.2.3 菌株QWC的毒性測(cè)定

用葉脈注射器將4 mL 1.2.2中得到的濾液注入大麥幼苗植株中并做好標(biāo)記，置于人工氣候室中光(20 ℃)暗(12 ℃)各12 h交替培養(yǎng)，7 d后在標(biāo)記處出現(xiàn)帶狀條紋說(shuō)明所得濾液含有毒素，為毒素液。

1.2.4 供試材料抗性測(cè)定

用70%的乙醇處理大麥種子(每個(gè)材料對(duì)照和處理各30粒種子)30 s后，用5%的次氯酸鈉處理5 min，經(jīng)無(wú)菌水沖洗4次后徹底晾干(約3 h)；將種子置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿上，濾紙事先用毒素液或無(wú)菌水(對(duì)照)潤(rùn)濕，蓋好蓋子置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h、48 h、72 h后調(diào)查大麥種子萌發(fā)數(shù)；120 h后測(cè)種子萌發(fā)抑制率及胚根和胚芽生長(zhǎng)抑制率[13]。3次重復(fù)。

萌發(fā)抑制率=(對(duì)照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù))/對(duì)照萌發(fā)數(shù)×100%

胚根/胚芽生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照胚根/胚芽長(zhǎng)-處理胚根/胚芽長(zhǎng))/(對(duì)照胚根/胚芽長(zhǎng))×100%

1.2.5 大麥防御酶活性及代謝物相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

選擇高抗大麥材料按照1.2.4中方法將種子培養(yǎng)48 h、 72 h、120 h、168 h后，每個(gè)處理分別采樣5 g，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。過(guò)氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測(cè)定；過(guò)氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定；游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮法測(cè)定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運(yùn)用Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥條紋病菌培養(yǎng)液毒性測(cè)定

將含QWC代謝物的濾液注入大麥葉片7 d后發(fā)現(xiàn)，從葉片基部到葉尖出現(xiàn)多條與葉脈相平行的細(xì)長(zhǎng)條紋，顏色呈黃褐色(圖1)。這些癥狀與條紋病的發(fā)病癥狀相一致。因此，可以認(rèn)為所得濾液對(duì)大麥有致病作用，為毒素液。

2.2 大麥條紋病菌毒素液對(duì)大麥種子生長(zhǎng)的 影響

2.2.1 對(duì)大麥種子萌發(fā)的影響

萌發(fā)24 h和48 h時(shí)，毒素液處理大麥材料的外觀與各自的對(duì)照無(wú)明顯差異；萌發(fā)72 h和120 h時(shí)，毒素液處理材料胚根和胚芽的長(zhǎng)勢(shì)均明顯較各自對(duì)照弱，說(shuō)明大麥條紋病菌毒素對(duì)大麥萌發(fā)有一定抑制作用。部分材料處理與相應(yīng)對(duì)照見(jiàn)圖2。

2.2.2 供試大麥材料萌發(fā)及生長(zhǎng)指標(biāo)分析

根據(jù)種子萌發(fā)抑制率對(duì)20個(gè)材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3，當(dāng)歐氏距離為15時(shí)，20個(gè)大麥材料被分為3類，Ⅰ型(1，5%)、Ⅱ型(12，60%)和Ⅲ型(7，35%)。對(duì)3個(gè)類型材料間的萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，毒素下3個(gè)類型材料間的萌發(fā)抑制率、胚芽生長(zhǎng)抑制率和胚根生長(zhǎng)抑制率的差異均達(dá)顯著水平， Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分別為高抗型、中抗型和高感型。其中，高抗型僅包含一種材料，為甘啤2號(hào)。

表2 毒素對(duì)不同類型大麥材料種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of toxins on seed germination and growth of different types barley cultivars %

20個(gè)大麥材料在毒素液培養(yǎng)下的萌發(fā)抑制率、胚芽生長(zhǎng)抑制率和胚根生長(zhǎng)抑制率的平均值分別是10.43%、56.03%和77.69%，說(shuō)明較胚芽而言，毒素液對(duì)胚根的抑制作用更強(qiáng)。

毒素對(duì)甘啤2號(hào)的萌發(fā)抑制率及胚芽、胚根生長(zhǎng)抑制率相對(duì)于其他材料均為最低，因此，對(duì)甘啤2號(hào)在毒素脅迫下其體內(nèi)防御酶活性及游離脯氨酸、丙二醛含量的變化進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 大麥條紋病菌毒素對(duì)甘啤2號(hào)生理指標(biāo)的影響

2.3.1 對(duì)相關(guān)防御酶活性的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大麥中POD活性整體呈上升的趨勢(shì)，毒素液培養(yǎng)48、72、120、168 h的甘啤2號(hào)中POD活性分別較對(duì)照增加了 6.72%、14.99%、25.50%、27.03%，其中，在 120 h和168 h時(shí)，處理間差異達(dá)到顯著水平 (P<0.05)(圖4A)。麥芽中SOD活性總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在72 h時(shí)達(dá)到最低；4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；在120 h時(shí)，毒素液培養(yǎng)較對(duì)照的增幅最大，為 95.48%(圖4B)。麥芽中CAT活性也隨培養(yǎng)時(shí)間推移呈先降低后升高的趨勢(shì)，在72 h時(shí)達(dá)到最低，處理間差異不顯著，且顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)；在48 h、120 h和168 h時(shí)，毒素液培養(yǎng)與對(duì)照間差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；在168 h時(shí)，毒素液培養(yǎng)較對(duì)照的增幅最大，為49.63%(圖4C)。

2.3.2 對(duì)游離脯氨酸(Pro)及丙二醛(MDA)含量的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，甘啤2號(hào)的Pro含量整體呈上升趨勢(shì)，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)毒素液培養(yǎng)與無(wú)菌水培養(yǎng)間差異均顯著(P<0.05)；培養(yǎng)72 h后，Pro含量急劇增高，而在120 h之后增幅趨于平緩(圖5A)。MDA含量隨培養(yǎng)時(shí)間推移整體呈先上升后下降趨勢(shì)，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，處理間均存在顯著差異(P<0.05)，以72 h時(shí)差異最大(圖5B)。

3 討 論

大量研究表明，大部分植物病原真菌可產(chǎn)生毒素，這些毒素會(huì)對(duì)植物種子萌發(fā)及生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，如黑穗病病原菌可以破壞寄主的組織結(jié)構(gòu)，造成寄主組織壞死、胼胝質(zhì)沉積、電解質(zhì)滲漏，影響糜子植株的正常生長(zhǎng)[15]。田雪亮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜枯萎菌毒素對(duì)不同抗性品種的黃瓜胚根生長(zhǎng)均有抑制作用，并且抑制作用會(huì)隨處理濃度的增加而增強(qiáng)，但對(duì)抗病品種的抑制作用低于感病品種；楊繼芝[17]認(rèn)為，小麥胚根對(duì)禾谷鐮刀菌毒素的敏感性大于胚芽。本研究與前人研究結(jié)果基本一致，大麥紋枯病菌毒素可抑制大麥種子的萌發(fā)和胚根、胚芽的生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)供試材料的萌發(fā)抑制率進(jìn)行聚類分析，可將20個(gè)大麥品種分為3類，高抗型占5%，中抗型占60%，高感型占35%；大麥紋枯病菌毒素對(duì)不同抗性類型間大麥種子的萌發(fā)抑制率和胚根、胚芽生長(zhǎng)抑制率均存在顯著差異。但車建美等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜枯萎病菌粗毒素液對(duì)培養(yǎng)5～10 d的黃瓜種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)胚根也有促生長(zhǎng)作用，并且粗毒素液處理黃瓜幼苗明顯高于對(duì)照組。這與本研究結(jié)果不一致，其原因可能與病原菌及作物不同有關(guān)。

POD、SOD、CAT是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶，植物體內(nèi)自由基清除或抗氧化能力的強(qiáng)弱可以由防御酶的活性高低直接反映，因此防御酶活性可作為植物抗逆性的指標(biāo)[18]。植物在逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量Pro等有機(jī)物，以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境條件對(duì)植物生理代謝系統(tǒng)造成的損傷[19]。MDA的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[20]。關(guān)于植物病原菌與植物防御酶活性的關(guān)系有很多報(bào)道，孫潤(rùn)紅等[21]發(fā)現(xiàn)，感染枯草芽孢桿菌的小麥中POD、SOD以及CAT等防御酶活性有不同程度的提高。黃志磊[22]發(fā)現(xiàn)，受大麥葉斑病浸染的大麥中SOD、POD、CTA活性及Pro含量在各個(gè)時(shí)期均有所提高。楊繼芝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌粗毒素可使小麥抗病品種葉片中CAT活性增強(qiáng)，MDA含量下降。本研究中，受大麥條紋病菌毒素浸染后，甘啤2號(hào)的SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量在處理間存在明顯差異，在種子培養(yǎng)120 h和168 h時(shí)，被測(cè)指標(biāo)在處理間均有顯著差異。在培養(yǎng)72 h時(shí)，甘啤2號(hào)的SOD、CAT活性均達(dá)到最小值，而MDA含量達(dá)最大值，說(shuō)明甘啤2號(hào)在種子萌發(fā)第72 h時(shí)防御酶活性及Pro、MDA含量變化較大。

本研究從生理方面研究了接種大麥條紋病菌毒素后，大麥幼苗生長(zhǎng)及防御酶活性變化的關(guān)系。結(jié)果是否與大田生產(chǎn)一致還有待更多和長(zhǎng)時(shí)間、多品種試驗(yàn)。大麥條紋病菌毒素對(duì)大麥防御酶活性的影響的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。