張曉軍，楊文靜，暢志堅，常利芳，閆貴云，張樹偉，李 欣，喬麟軼，郭慧娟，雷夢林，賈舉慶，穆志新

(1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室, 山西太原 030031; 2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室, 山西太原 030031)

小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥專化型(PucciniastriiformisWest.f.sp.triticiEriks.)引起的一種嚴重威脅世界小麥生產(chǎn)的氣傳性真菌病害[1]，具有傳播速度快、變異頻率高、危害程度大等特點[2]。該病害發(fā)生時，一般年份可造成小麥減產(chǎn)5%～25%，嚴重時甚至絕收[3]。條銹病是中國小麥生產(chǎn)的重要病害之一，常年發(fā)病面積約為600萬hm2，占全國小麥總面積的四分之一，嚴重威脅著中國小麥生產(chǎn)的安全[4]?？共∑贩N的選育與應用是控制條銹病危害的有效途徑[5]，但由于小麥條銹菌毒性的快速變異，致使大多數(shù)品種抗性被條銹菌新小種所克服而不能持久利用。近年來由于條銹菌毒性小種CYR34的出現(xiàn)與流行，使中國原有抗源材料繁六、洛夫林10、水源86和貴農(nóng)22等相繼喪失抗性[6]，CYR34已成為當前中國小麥條銹菌重要的優(yōu)勢小種，存在條銹病大面積暴發(fā)的風險。因此，利用有效抗病基因快速選育抗條銹病品種成為當前小麥生產(chǎn)上亟待解決的重要問題。

分子標記可從DNA水平上追蹤與鑒定抗病基因，進行抗病性選擇時不受環(huán)境影響。利用分子標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection，MAS)可實現(xiàn)抗病基因在品種選育中的快速應用，有助于在生產(chǎn)上合理布局抗病基因和延長抗病品種使用年限[7]。目前，分子標記技術已在小麥抗病遺傳改良中得到廣泛應用。Robert等[8]利用SCAR(sequence characterized amplified regions)標記SC-Y15將Yr17基因轉入面包小麥品種中，改良了法國面包小麥的條銹病抗性。曾祥艷等[9]利用分子標記技術結合回交轉育的方法，將抗條銹病小麥種質YW243中的抗條銹病基因YrX轉入普通小麥中，選育出抗條銹病小麥新品系CB032。但是，有些抗病基因的連鎖標記僅在基于特定材料構建的遺傳群體中有效，常隨著遺傳背景的改變失去作用，因而，利用不同品種構建的群體對現(xiàn)有標記在不同遺傳背景中的有效性及選擇的準確率進行評價是非常必要的[10]。

Yr69的載體品系CH7086來源于組合“中8701/小偃7430//冀麥26///冀麥26”的BC2F7品系，對CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、CYR34(G22-9)等多個小麥條銹菌小種表現(xiàn)為高抗或免疫，目前，Yr69是中國條銹菌優(yōu)勢流行小種的有效抗病基因。Hou等[11]利用分子標記將CH7086的抗條銹病基因Yr69定位于小麥2AS染色體上，篩選到8個與Yr69連鎖的分子標記，其側翼分子標記分別為X2AS33和Xmag3807，與Yr69的遺傳距離分別為1.9 cM和3.1 cM。為了驗證Yr69連鎖標記在其他遺傳背景中的有效性，本研究利用Yr69的8個連鎖標記，對長4738和CH7086(Yr69)構建的F2群體進行檢測，并利用小麥條銹菌接種F2:3家系鑒定條銹病抗性，以期評價標記檢測的有效性，為Yr69在小麥育種中的抗性遺傳與分子標記輔助選擇育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料CH7086由山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供。國審小麥品種長4738由山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所提供，經(jīng)成株期鑒定高感條銹病。由“長4738/CH7086”構建的372個F2群體用于分子標記檢測，F(xiàn)2:3家系用于抗條銹病測定。條銹病鑒定所用條銹菌小種CYR32、CYR33和CYR34，與感病對照品種Taichung 29和條銹病誘發(fā)品種川育12均來自四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所。

1.2 分子標記

8個與Yr69連鎖的分子標記用于基因型檢測[11]，分別為Xbarc124、Xwmc25、Xwmc382、Xmag3807、Xgwm210、Xgpw7101、Xgwm636和X2AS33，其中Xwmc382、Xgwm210、Xgwm636和X2AS33為共顯性標記，其他4個為隱性標記。引物信息見表1。

表1 與抗條銹病基因 Yr69連鎖的分子標記信息

1.3 DNA提取與PCR擴增

剪取三葉期幼苗葉片，置于2 mL離心管中，液氮冷凍后用研磨棒研磨成粉末，采用改良CTAB法[12]提取基因組DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計(賽默飛，美國)測定DNA濃度，取少量DNA原液稀釋至50 ～ 80 ng·μL-1用于PCR擴增，其余DNA原液置于-20 ℃保存。

PCR反應體系為10 μL，包括DNA模板2.0 μL，10×PCR buffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.7 μL，25 mmol·L-1MgCl20.7 μL，50 μmol·L-1引物0.7 μL，5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.1 μL，ddH2O 4.8 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，退火 45 s，退火溫度見表1，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增產(chǎn)物加入2 μL 6 × loading buffer, 混勻后用8%(m/v)非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶N,N′-甲叉雙丙烯酰胺= 29∶1)電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，電泳條件為恒壓220 V，電泳時間50 min，硝酸銀染色30 min后拍照并統(tǒng)計電泳帶型。

1.4 抗條銹病鑒定

采用成株期鑒定的方法，于2016-2018年在四川省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園進行。2016年10月30日至11月10日，將長4738、CH7086及其雜交F2群體播種于田間，行長2 m，行距25 cm，每行播種20粒，每隔10行播種1行對照品種Taichung 29，每行兩端和試驗田四周條播川育12用于誘發(fā)條銹病。翌年1月中旬，采用噴霧法[13]接種等量混合的小麥條銹菌小種CRY32、CRY33和CYR34[14]的夏孢子懸浮液。約3月中下旬，待感病品種條銹病充分發(fā)病時，調查親本及F2群體每個單株對條銹病的反應型，調查方法采用0 ～ 9級的分級標準[15]，其中0級為免疫，1 ～ 6級為抗病，7 ～ 9級為感病。

F2群體按單株收獲后，2017年將其F2:3家系再次播種，每個家系播種1行，每行播種20粒，隨機區(qū)組設計，設3次重復。采用與上述相同的接種方法與鑒定方法，調查F2:3家系每個單株對條銹病的抗性反應。根據(jù)F2:3家系中植株對條銹病的抗、感反應推導其F2單株的基因型。

2 結果與分析

2.1 F2與F2:3家系的條銹病抗性

用小麥條銹菌混合小種對“長4738/CH7086”的372個F2群體接種鑒定結果表明，表現(xiàn)為抗病的植株數(shù)量為287個，表現(xiàn)為感病的植株數(shù)量為85個。其F2:3家系的鑒定結果表明，在287個抗病F2植株的F2:3家系中，有89個表現(xiàn)為純合抗??；98個則表現(xiàn)為雜合性，存在抗、感病分離。

2.2 F2群體基因型的分離規(guī)律

基因型檢測結果(表2)表明，4個共顯性標記Xgwm636、Xgwm210、Xwmc382和X2AS33在“長4738/CH7086”F2群體中的檢測結果符合 1∶2∶1的分離比；4個隱性標記Xwmc25、Xmag3807、Xgpw7101和Xbarc124符合1∶3的分離比。以上結果說明，Yr69在“長4738/CH7086”的F2群體中符合顯性單基因遺傳規(guī)律。

表2 Yr69連鎖標記基因型在“長4738/CH7086”F2群體中的分離規(guī)律

2.3 分子標記鑒定的準確性

利用Yr69連鎖標記篩選出的純合抗病基因型家系中，4個共顯性標記Xgwm636、Xgwm210、Xwmc382和X2AS33基因型與表現(xiàn)型符合率分別為76.0%、83.3%、86.3%和96.7%；4個隱性分子標記Xwmc25、Xmag3807、Xgpw7101和Xbarc124的基因型與表現(xiàn)型符合率分別為87.5%、90.5%、83.0%和71.2%(表3)。

利用8個連鎖標記都可在“長4738/CH7086”的遺傳群體中檢測到抗條銹病基因Yr69，所篩選到純合抗病基因型的株系數(shù)量隨著分子標記與Yr69連鎖遺傳距離的增加而逐漸增多，但實際上其所含有的純合抗病表型株系數(shù)量卻呈現(xiàn)減少的趨勢，且表型與基因型符合率(表型與基因型符合率=純合抗病表型株系數(shù)/純合抗病基因型株系數(shù)×100%)，以及對純合抗病株系的篩選率(檢測率=篩選出的純合抗病株數(shù)/純合抗病表型株系數(shù)×100%)也呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(表3)，表明分子標記在檢測群體中表現(xiàn)型與基因型的符合率與其與Yr69的遺傳距離有關。其中，X2AS33篩選出的91個純合抗病基因型家系中，有88個表型為純合抗病，3個表型為純合感病或抗感分離，表型與基因型的符合率為96.7%；同時在整個群體的89個純合抗病家系中，X2AS33篩選出的88個，僅1個家系的基因型與抗病性鑒定結果不符，檢測率為98.9%。這表明，標記X2AS33在8個連鎖標記中對Yr69的檢測準確度最高，是Yr69較理想的連鎖分子標記。X2AS33的PCR擴增帶型見圖1，可以看出，純合抗病基因型AA家系的目的條帶與Yr69的載體品系CH7086一致，進一步說明使用標記X2AS33對抗條銹病基因Yr69的檢測效果較好，可用于該基因的分子輔選擇育種。

M：Marker；P1：CH7086；P2：長4738；1～10：AA基因型家系；11～20：aa基因型家系。

表3 Yr69連鎖標記檢測抗病株系的有效性

3 討 論

迄今，國際上已鑒定出83個正式命名的抗條銹病基因[16]，這些基因多為質量性狀基因。隨著條銹菌毒性的不斷變異，含該類抗條銹病基因的品種在生產(chǎn)上大面積種植后極易喪失抗條銹性[17]。將不同抗病基因聚合到同一品種中，可提高該品種的抗病性并延長其使用年限，是解決這一生產(chǎn)問題的有效措施[18]。目前，國內(nèi)外已獲得大量與抗條銹病基因相關的分子標記，除Yr5[19]、Yr7[19]、Yr10[20]、Yr15[21]、Yr18[22]、Yr36[23]、Yr46[24]等少數(shù)克隆基因已獲得共分離標記外，大多數(shù)分子標記是基于特定遺傳群體進行染色體定位而獲得的連鎖標記，這些連鎖標記往往需要在特定的遺傳背景中才能有效鑒定目標基因，在用于分子標記輔助育種時需要用不同遺傳背景的分離群體驗證其檢測目的基因的有效性。

Yr69對小麥條銹病多個小種具有優(yōu)良抗性，利用生產(chǎn)品種檢測其連鎖標記在不同遺傳背景中的有效性，可為Yr69的分子標記輔助育種提供必要的參考。長4738具有豐產(chǎn)性突出、穩(wěn)產(chǎn)性好、適應性廣的特點，但因其高感條銹病、葉銹病和稈銹病[25]，使其在生產(chǎn)上的應用受到限制。利用“長4738/CH7086”群體既可以檢測Yr69連鎖標記在其他遺傳背景中的有效性，也可為抗條銹病育種提供候選材料。本研究結果表明，Yr69的8個連鎖標記在長4738背景中都可以進行抗病基因篩選，其中X2AS33與Yr69的連鎖距離最小，檢測的準確率也最高。Peng等[26]認為使用與目的基因遺傳距離小于2 cM的分子標記，可以獲得90%以上的鑒定效率。本研究使用的4個共顯性標記中，僅有X2AS33與Yr69的遺傳距離小于2 cM，利用其篩選得到的91株AA基因型家系中，有88株表現(xiàn)為純合抗病，基因型與表型的符合率達到96.7%，這表明，在“長4738/CH7086”群體中使用X2AS33進行抗條銹病基因Yr69的鑒定可獲得較理想的篩選效果。

隱性分子標記在PCR擴增純合抗病植株時表現(xiàn)為帶型缺失，且無法區(qū)分雜合抗病株系與感病株系，往往用于反向推理抗病基因的存在與否，在分子標記輔助選擇中的應用受到很大限制。因此，雖然4個隱性分子標記Xmag3807、Xwmc25、Xgpw7101和Xbarc124在“長4738/CH7086”雜交群體中也可以獲得較高的鑒定效率，但其易受遺傳背景的影響，在分子標記輔助育種中應盡量避免使用隱性標記。

在兩個品種雜交后代的基因組發(fā)生交換時，分子標記與目標基因會發(fā)生一定概率的重組，重組率越低則選擇效率越高，其選擇效率受標記與目標基因遺傳距離的限制[27]。因此，利用連鎖標記選擇抗病基因時，應盡可能使用與目標基因遺傳距離較近的側翼標記。為獲得更高的分子標記選擇效率，還需進一步開發(fā)與Yr69緊密連鎖的標記或共分離標記，構建Yr69的高密度飽和遺傳圖譜，這對實現(xiàn)Yr69的精細定位或克隆是十分必 要的。