曹志琛，吳 嫻，汪德州，柳 珊，楊慧玉，郝小聰，房兆峰，朱文根，王偉偉，王小燕，唐益苗

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心，北京 100097)

多蛋白橋梁因子1(multiprotein bridging factor 1，MBF1)廣泛存在于植物中，通過(guò)橋連轉(zhuǎn)錄激活因子(如FT2-F1和GCN4)和TATA-box結(jié)合蛋白(TBP)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活[1-9]，增強(qiáng)植物在逆境脅迫中的抗性[10-14]。在真核生物(酵母、果蠅、小鼠、人等)中，MBF1僅由單個(gè)基因編碼，而在植物中，MBF1由多個(gè)基因碥碼。擬南芥基因組包含三個(gè)MBF1基因MBF1a、MBF1b和MBF1c，根據(jù)其進(jìn)化關(guān)系，MBF1a和MBF1b歸為一類，MBF1c則歸為另一類[7,10]。MBF1蛋白主要由N端‘MBF1’結(jié)構(gòu)域和C端‘helix-turn-helix’結(jié)構(gòu)域組成[4]。Ozaki等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MBF1轉(zhuǎn)錄因子互作的核心區(qū)域位于N端，N端沒(méi)有保守的高級(jí)結(jié)構(gòu)，BmMBF1蛋白N端的不同構(gòu)象使其與不同伴侶的作用能力有所差異。在植物中尚未見(jiàn)N末端結(jié)構(gòu)域報(bào)道。體外試驗(yàn)表明，擬南芥MBF1可通過(guò)連接酵母中的GCN4轉(zhuǎn)錄激活因子和TBP來(lái)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，這表明N末端結(jié)構(gòu)域在真菌和植物之間具有類似的功能[7]。C末端‘helix-turn-helix’結(jié)構(gòu)域是TBP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在所有物種中高度保守[3, 16]。

MBF1在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。在擬南芥中，MBF1c在葉和根中表達(dá)量較高，在培養(yǎng)14、21和28 d后，各組織中均檢測(cè)到pMBF1c::GUS的活性[10]。擬南芥[10,17]、水稻[12]、苔蘚[18]、酵母[12]和紅藻[14]MBF1c在受熱脅迫誘導(dǎo)后均上調(diào)表達(dá)。MBF1c通過(guò)調(diào)節(jié)水楊酸、海藻糖和乙烯相關(guān)蛋白[17]，與TBP互作，激活未知的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)HSP等熱響應(yīng)基因(HR基因)的表達(dá)，從而增強(qiáng)耐熱性[12,19]。Qin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中過(guò)表達(dá)葡萄VvMBF1導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性，在脫落酸(ABA)依賴的干旱響應(yīng)途徑中發(fā)揮作用的干旱響應(yīng)相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)。

小麥作為世界主要糧食作物，干旱和熱脅迫是制約小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要逆境因子，探討干旱和熱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)展小麥抗逆分子育種具有重要意義[21-22]。據(jù)報(bào)道，小麥7B染色體上的MBF1c受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[12]，但其亞基因組成員功能未知。因此，本研究以中國(guó)春小麥品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考序列，克隆了小麥TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因，并系統(tǒng)分析其對(duì)干旱和熱脅迫的響應(yīng)，以期為探討TaMBF1c在小麥非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理方法

供試材料為苗期旱熱敏感小麥品種小白麥、耐旱小麥品種太原806和耐熱小麥品種京麥8號(hào)，均由北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。

選取成熟飽滿大小均勻一致的小白麥、太原806和京麥8號(hào)種子，用75%的酒精消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3次，隨后用5% NaClO消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，于滅菌水中浸泡24 h后將種子移種到水培盒中，每1 d更換一次水培液。將水培盒放入光溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度設(shè)置為24 ℃/18 ℃(光照14 h/黑暗10 h)。待小白麥、太原806和京麥8號(hào)幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí)，分成兩組，第一組進(jìn)行干旱脅迫處理，將小白麥和太原806幼苗置于無(wú)水培液的空水培盒中培養(yǎng)，其余培養(yǎng)條件與處理前相同，分別在0、1、2、6、12和24 h后取整株幼苗；第二組進(jìn)行熱脅迫處理，將小白麥和京麥8號(hào)幼苗置于40 ℃條件下，其余培養(yǎng)條件與處理前也相同，分別在熱脅迫0、0.25、0.5、1、2和4 h后取整株幼苗[23]。處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜谔崛NA。

利用75%酒精和15%NaClO對(duì)小麥種子進(jìn)行消毒，并于2019年10月5日播種于北京市農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田中，經(jīng)春化作用(溫度在4 ℃以下，40 d 以上)后移入人工可控溫室，模擬大田自然環(huán)境培養(yǎng)至孕穗期，分別取小麥根、莖、葉和穎殼等組織，并在灌漿14 d后取其種子，并迅速置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取小麥不同組織器官及幼苗總RNA[23]，測(cè)定OD260/280值，同時(shí)利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥 MBF1c基因的克隆

根據(jù)小麥已發(fā)表的與耐熱性相關(guān)的多蛋白橋梁因子基因MBF1c(TraesCS7B02G259000)，用Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行基因序列同源性檢索，選取相似度達(dá)97.35%的序列TraesCS7A02G 369500.1和96.75%的序列TraesCS7D02G 353800.1，設(shè)計(jì)引物TaMBF1c-A-F/R、TaMBF1c-B-F/R、TaMBF1c-D-F/R(表1)。

以小白麥、太原806和京麥8號(hào)幼苗的cDNA作為模板進(jìn)行TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板cDNA(100 ng·L-1)1 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸為50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，在室溫條件下(25 ℃)連接pEASY-T1 Zero載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，反應(yīng)時(shí)間為5～10 min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，然后將菌液均勻涂抹到含有卡那霉素(濃度100 ng·L-1)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)13～16 h后，經(jīng)菌落PCR鑒定后，每個(gè)樣品選取3個(gè)單克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 TaMBF1c蛋白的生物信息學(xué)分析

用Pfam(http://pfam.xfam.org)預(yù)測(cè)TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的蛋白結(jié)構(gòu)，用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關(guān)于基因的cDNA序列和染色體位置的信息。

用Protein Sequence Vs Profile-HMM Database(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)在線程序?qū)aMBF1c同源蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證，保留具有MBF1結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。用MEGA 7.0的ClustalW程序?qū)ζ胀ㄐ←?T.aestivum)、烏拉爾圖小麥(T.urartu)、大麥(Hordeumvulgare)、粗山羊(Aegilopstauschii)、二粒小麥(T.dicoccum)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)9個(gè)物種的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用泊松校正模型，bootstrap值設(shè)置為1 000。用DNAMAN V6進(jìn)行可視化。

1.5 TaMBF1c基因的表達(dá)分析

表1 引物名稱及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 TaMBF1c基因克隆及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

以小白麥、太原806和京麥8號(hào)幼苗的cDNA為模板，利用引物TaMBF1c-A-F/R、TaMBF1c-B-F/R和TaMBF1c-D-F/R(表1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)品種擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小完全一致，從圖1可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小為500～600 bp左右。將目的片段純化、克隆并測(cè)序后，經(jīng)Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)報(bào)道的TaMBF1c(TraesCS7B02G259000)的相似率高達(dá)95%以上，根據(jù)染色體位置將其暫時(shí)命名為TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D。通過(guò)比較基因組區(qū)域(http://plants.ensembl.org/index.html)和全長(zhǎng)cDNA序列確定TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的結(jié)構(gòu)，其中，TaMBF1c-A轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度為660 bp，含有579 bp的編碼序列和81 bp的3′非翻譯區(qū)(UTR)；TaMBF1c-B轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度為631 bp，含有471 bp的編碼序列、76 bp的5′UTR和 84 bp的3′UTR；TaMBF1c-D轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度為492 bp，含有465 bp的編碼序列、15 bp的5′UTR和12 bp的3′UTR。預(yù)測(cè)TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白長(zhǎng)度分別為151、156和154個(gè)氨基酸，并通過(guò)多序列比對(duì)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，其C端都具有MBF1結(jié)構(gòu)域，且N端都具有helix-turn-helix結(jié)構(gòu)域(圖2)，說(shuō)明TaMBF1基因?qū)儆贛BF1基因家族。

A：TaMBF1c-A擴(kuò)增產(chǎn)物；B：TaMBF1c-B擴(kuò)增產(chǎn)物；D：TaMBF1c-D擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DL2000。

A：TaMBF1c同源蛋白多序列比對(duì)圖。藍(lán)色底紋的氨基酸表示序列完全匹配，青色底紋的氨基酸表示序列匹配有差異，黑色線條表示MBF1結(jié)構(gòu)域，紅色線條表示helix-turn-helix結(jié)構(gòu)域，紅色方框表示helix-turn-helix結(jié)構(gòu)域中4個(gè)α螺旋的位置，黃色方框表示第112位氨基酸；B：TaMBF1c同源蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。藍(lán)色為第一個(gè)螺旋，青色為第二個(gè)螺旋，橙色為第三個(gè)螺旋，紅色為最后一個(gè)螺旋，灰線為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；C：TaMBF1c同源蛋白三維結(jié)構(gòu)擬合模型圖。藍(lán)色方塊表示其結(jié)構(gòu)不同；D：TaMBF1c同源蛋白三維結(jié)構(gòu)擬合模型局部圖。

利用在線軟件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk)預(yù)測(cè)TaMBF1c蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)Swiss-PdbViewer軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果(圖3A)發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均具有四個(gè)互相親和的α螺旋和一段可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。對(duì)TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白結(jié)構(gòu)擬合(圖3B-D)發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)為C端的無(wú)規(guī)卷曲，其長(zhǎng)度差異表現(xiàn)為TaMBF1c-D>TaMBF1c-A>TaMBF1c-B，結(jié)果說(shuō)明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白可能與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力不同。

2.2 TaMBF1c同源蛋白序列的比對(duì)與分析

從圖3可以看出，單子葉和雙子葉植物的MBF1c蛋白分別聚為一類，TaMBF1c-A(TraesCS7A02G369500.1)蛋白序列與二粒小麥(TRIDC7AG051580.2)的親緣關(guān)系最近；TaMBF1c-B(TraesCS7B02G259000.1)蛋白序列與二粒小麥(TRIDC7BG0442320.1)的親緣關(guān)系最近；TaMBF1c-D(TraesCS7D02G353800.1)蛋白序列與粗山羊草(AET7Gv20881700.1)的親緣關(guān)系最近。

At：擬南芥；Os：水稻；Ae：粗山羊草；Ta：小麥；Td：二粒小麥；Tu：烏拉爾圖小麥；Hv：大麥；St：馬鈴薯；Sl：番茄。

2.3 TaMBF1c基因的順式作用元件分析

通過(guò)Ensembl Plants網(wǎng)站搜索TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因上游2 000 bp序列，利用DNAMAN V6進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D都具有干旱響應(yīng)元件和熱響應(yīng)元件。

在TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因序列中均只含有1個(gè)干旱響應(yīng)元件(MBS element/MYB element)，但位置和序列組成不同，其中，TaMBF1c-A啟動(dòng)子區(qū)5′端119～124 bp處有干旱響應(yīng)元件MYB element，序列為CAACAG；TaMBF1c-B和TaMBF1c-D分別在啟動(dòng)子區(qū)3′端1 769～1 774 bp和1 768～ 1 775 bp處有干旱響應(yīng)元件MBS element，序列均為CAACTG。熱響應(yīng)元件HSE element(nGAAn/nTTCn)在TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D中的數(shù)目、位置和序列組成各不相同，其中，TaMBF1c-A啟動(dòng)子區(qū)5′端有3個(gè)熱響應(yīng)元件，位置分別為1 631～1642 bp、1 775～ 1 790 bp和1 812～1 823 bp，序列分別為 CAGAATTTGAAT、AGAATCTTCCAGAAC和CATGAACCTTCC；TaMBF1c-B啟動(dòng)子區(qū)有4個(gè)熱響應(yīng)元件，位置分別為1 588～1 596 bp、1 643～1 654 bp、1 786～1 800 bp和1 821～ 1 832 bp，序列分別為CGAATTCCA、CAGAATTTGAAT、AGAACCTTCCAGACC和CAGGAACCTTCC；TaMBF1c-D啟動(dòng)子區(qū)5′端有4個(gè)熱響應(yīng)元件，位置分別為1 582～1590 bp、1 642～1 653 bp、1 785～1799 bp和1 820～1831 bp，序列分別為CGAATTCCA、CAGAATTTGAAT、AGAACCTTCCAGACC和CAGGAA-CCTTCC。推測(cè)這些啟動(dòng)子元件的差異可能會(huì)導(dǎo)致3個(gè)TaMBF1c基因在受到干旱和熱脅迫后的表達(dá)量不同。

2.4 TaMBF1c基因的組織特異性表達(dá)分析

利用Wheat Exp(https://wheat.pw.usda.gov)網(wǎng)站對(duì)不同組織中TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-A和TaMBF1c-B均在葉片中的表達(dá)量較高，籽粒次之，而在根、莖和穎殼中的表達(dá)量較低。通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證基因的組織表達(dá)特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaMBF1c-A和TaMBF1c-B基因在根、葉片和籽粒中均有表達(dá)，TaMBF1c-A主要在葉片中表達(dá)，而TaMBF1c-D僅在根部中特異性表達(dá)。

圖4 小麥 TaMBF1c基因在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量

2.5 TaMBF1c基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

以小白麥和太原806為試驗(yàn)材料，待培養(yǎng)至一葉一心期時(shí)，進(jìn)行干旱處理。干旱脅迫24 h后，小白麥幼苗葉片萎蔫，莖稈倒伏，而太原806葉片雖出現(xiàn)萎蔫，但植株大部分直立(圖5A)，表明苗期太原806比小白麥表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐 旱性。

為分析TaMBF1c基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)模式，對(duì)小白麥和太原806進(jìn)行干旱處理，RT-qPCR結(jié)果(圖5B)表明，干旱脅迫下，小白麥中的TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因均上調(diào)表達(dá)，且均在6 h時(shí)表達(dá)量急劇升高，達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量急劇下降。而太原806中TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達(dá)量變化不明顯，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小白麥。這些結(jié)果說(shuō)明，抑制TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的表達(dá)可提高小麥的抗旱性。

A：小白麥和太原806干旱脅迫24 h的生長(zhǎng)情況；B：小白麥和太原806中TaMBF1c基因在干旱脅迫后的表達(dá)情況。

2.6 TaMBF1c基因在熱脅迫下的表達(dá)分析

以小白麥和京麥8為試驗(yàn)材料，待培養(yǎng)至一葉一心期時(shí)，進(jìn)行熱脅迫處理。從圖6A可以看出，熱脅迫24 h后，小白麥幼苗大部分葉片萎蔫，莖稈失水、倒伏，而京麥8號(hào)幼苗葉片僅出現(xiàn)輕度萎蔫。結(jié)果表明，京麥8號(hào)比小白麥表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性。

為了分析TaMBF1c基因在熱脅迫條件下的表達(dá)模式，對(duì)小白麥和京麥8進(jìn)行熱處理，RT-qPCR分析結(jié)果(圖6B)表明，小白麥和京麥8中的TaMBF1c-A基因在受熱脅迫后均上調(diào)表達(dá)，在0.5 h達(dá)到峰值；小白麥和京麥8中的TaMBF1c-B基因受熱脅迫后均上調(diào)表達(dá)，但在京麥8中的表達(dá)量明顯高于小白麥，在4 h達(dá)到最大值；小白麥中的TaMBF1c-D基因受熱脅迫后上調(diào)表達(dá)，但在京麥8中的表達(dá)量變化不明顯，且比小白麥表達(dá)量低。這些結(jié)果表明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在熱脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑中發(fā)揮不同的作用。

A：小白麥和京麥8號(hào)熱脅迫24 h的生長(zhǎng)情況；B：小白麥和京麥8號(hào)中在熱脅迫后 TaMBF1c基因的表達(dá)情況。

3 討 論

MBF1蛋白廣泛存在于各種植物中，在擬南芥[17,24]、水稻[12]、小麥[12]和葡萄[20]等植物中均有報(bào)道。小麥基因組內(nèi)大多數(shù)基因都存在序列相似的三個(gè)同源拷貝基因[25]，已有研究發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-B(TaMBF1c)能夠提高轉(zhuǎn)基因小麥抗旱能力[12]。本研究通過(guò)小麥基因組參考序列，在小麥中同源克隆了該基因的同源基因TaMBF1c-A和TaMBF1c-D。序列比對(duì)結(jié)果表明，TaMBF1c-A和TaMBF1c-D基因所編碼的氨基酸序列與TaMBF1c-B的氨基酸序列同源性極高，且含有1個(gè)MBF1保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)helix-turn-helix結(jié)構(gòu)域。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D三個(gè)基因C末端helix-turn-helix結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸是TBP結(jié)合位點(diǎn)[3,9,15]。Kenichi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)同源基因N末端存在與轉(zhuǎn)錄因子互作的結(jié)構(gòu)域，且在N端存在長(zhǎng)短不一的loop結(jié)構(gòu)，TaMBF1c-B最短，TaMBF1c-A和TaMBF1c-D間也存在差異，推測(cè)其結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致構(gòu)象變化進(jìn)而影響相互作用的能力[3, 7]。小麥與水稻、擬南芥等物種的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，小麥祖先種烏拉爾圖小麥與擬南芥、番茄和土豆的進(jìn)化關(guān)系較近，說(shuō)明TaMBF1c基因可能是從雙子葉植物進(jìn)化而來(lái)。

TaMBF1c在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[12]。Takuto等[26]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMBF1在葉片特異表達(dá)，不僅影響葉細(xì)胞的擴(kuò)張，而且還影響葉擴(kuò)張階段葉細(xì)胞的倍性水平。在本研究中，TaMBF1c-A和TaMBF1c-B在葉片中高表達(dá)，具有葉片表達(dá)特異性，推測(cè)它們可能與小麥葉片細(xì)胞的擴(kuò)張有關(guān)；而TaMBF1c-D在根部特異性表達(dá)，推測(cè)可能與小麥根部發(fā)育有關(guān)，這些結(jié)果說(shuō)明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在小麥不同器官中發(fā)揮著不同作用，TaMBF1c-D可能在長(zhǎng)期進(jìn)化中出現(xiàn)了新的功能。

TaMBF1c啟動(dòng)子作用元件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，干旱響應(yīng)元件(MYB element/MBS element)在TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因CDS區(qū)近端，在TaMBF1c-A基因CDS區(qū)遠(yuǎn)端；本研究還發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-A在小白麥干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量高于TaMBF1c-B和TaMBF1c-D，說(shuō)明干旱響應(yīng)元件MYB element與基因CDS區(qū)的距離遠(yuǎn)近可能會(huì)影響TaMBF1c的表達(dá)量。熱響應(yīng)元件HSE element在TaMBF1c-A基因啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)，而在TaMBF1c-B和TaMBF1c-D各有4個(gè)；且TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的HSE element元件各不相同。在本研究中，無(wú)論在熱敏感或耐熱小麥中，TaMBF1c-A的表達(dá)量遠(yuǎn)高于TaMBF1c-B和TaMBF1c-D。推測(cè)TaMBF1c響應(yīng)干旱和熱脅迫的表達(dá)變化可能與啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件序列的位置、數(shù)目或堿基組成差異有關(guān)[27]。

目前，在擬南芥和葡萄中發(fā)現(xiàn)MBF1c受到干旱誘導(dǎo)時(shí)上調(diào)表達(dá)[10,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因在耐旱小麥中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于敏感小麥，可能耐旱小麥中啟動(dòng)子序列與敏感小麥不同，或者感知信號(hào)途徑不同而引起表達(dá)量的差異。TaMBF1c可能響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)機(jī)制，是作物抗旱育種優(yōu)異的候選基因資源。利用Cas9技術(shù)抑制TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達(dá)，可能增強(qiáng)小麥的耐 旱性。

前人報(bào)道，MBF1c參與熱響應(yīng)相關(guān)途徑，高表達(dá)可增強(qiáng)植物耐熱性[17-18]。Qin等[12]報(bào)道，在熱脅迫下可誘導(dǎo)小麥MBF1c(TaMBF1c-B)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，TaMBF1c-B基因在熱敏感和耐熱小麥中受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但在耐熱小麥中表達(dá)量明顯高于熱敏感小麥；且TaMBF1c-A基因在熱敏感或耐熱小麥中受熱誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)一致，說(shuō)明TaMBF1c-A和TaMBF1c-B正向調(diào)控小麥的耐熱性，但TaMBF1c-A的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TaMBF1c-B，因此，TaMBF1c-A在耐熱調(diào)控過(guò)程中可能起主要作用。在熱脅迫條件下，TaMBF1c-D僅在熱敏感小麥中高表達(dá)，而耐熱小麥中TaMBF1c-D低于熱敏感小麥，且TaMBF1c-D在根部特異表達(dá)。因此，熱脅迫信號(hào)途徑中，精確地調(diào)控TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達(dá)可影響小麥的耐熱性。