朱政清，白維曉，湯雯婷，李海燕

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】土隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快，土壤重金屬污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重。在中國(guó)，已有近1/6的耕地(約2000萬(wàn)km2)受到了不同程度的重金屬污染，給原本就有限的耕地資源帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。此外，由于土壤重金屬具有較強(qiáng)的隱蔽性、自然條件下難以降解，其危害往往是多層次、多方面的。在世界范圍內(nèi)，已有許多關(guān)于土壤重金屬污染引起人類疾病的報(bào)道[3]，其中包括人體生殖功能疾病，造成胎兒畸形生長(zhǎng)，影響兒童和成人的身體素質(zhì)，對(duì)人們正常生活造成威脅等[2]。因此，污染土壤的修復(fù)成為環(huán)境研究熱點(diǎn)之一。【前人研究進(jìn)展】目前的修復(fù)方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)等。在所有修復(fù)方法中，植物微生物聯(lián)合修復(fù)因其原位、環(huán)保、費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單等特征在重金屬污染土壤修復(fù)中展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景[4-6]，其中植物-內(nèi)生菌聯(lián)合修復(fù)已經(jīng)取得了一定進(jìn)展[7-10]。內(nèi)生菌指生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起宿主植物明顯癥狀改變的微生物。由于與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，形成互利共生關(guān)系，一方面內(nèi)生菌可以從植物獲取營(yíng)養(yǎng)和避難所，反過(guò)來(lái)，內(nèi)生菌也能增強(qiáng)宿主植物的抗逆性[11]。在重金屬脅迫環(huán)境中，植物內(nèi)也定殖有一定數(shù)量的內(nèi)生菌[12-13]。內(nèi)生菌通過(guò)產(chǎn)生抗氧化酶、植物促生激素、脫氨酶和脫羧酶等增強(qiáng)植物的抗氧化能力，提高其重金屬抗性，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，降低重金屬對(duì)植物的傷害，在提高宿主生物量的同時(shí)，增加植物對(duì)重金屬的吸收和積累，提高修復(fù)效率[14]。有研究表明，植物內(nèi)生菌具有吸附(收)重金屬的能力，從而起到固定重金屬離子，降低其在植株內(nèi)部的含量，從而減輕重金屬脅迫強(qiáng)度[15]。【本研究切入點(diǎn)】通過(guò)前期研究，從重金屬超富積植物小花南芥(Arabisalpina)的種子分離獲得一株重金屬耐受菌株FXZ2(黑附球菌，Epicoccumnigrum)，在重金屬脅迫條件下，該菌株能夠顯著促進(jìn)小花南芥的生長(zhǎng)，影響其重金屬累積能力。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索菌株FXZ2對(duì)玉米生長(zhǎng)及重金屬累積的影響，為FXZ2的應(yīng)用、以及內(nèi)生菌與植物互作機(jī)制的探索提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米種子為云南曲辰種業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的會(huì)單4號(hào)(滇玉14號(hào))玉米種子。

礦渣堆土壤樣品于2017年8月10日采于云南省曲靖市會(huì)澤縣(26°28′N, 103°37′E，海拔2273 m)。采回的土壤樣品于室溫下自然風(fēng)干、備用。

1.2 無(wú)菌苗的獲得

隨機(jī)挑選玉米種子按下列程序進(jìn)行表面消毒：用體積分?jǐn)?shù)為75 %的乙醇溶液表面消毒10 min，后用無(wú)菌水漂洗6次，再用有效氯體積分?jǐn)?shù)為10 % NaClO溶液表面消毒10 min，無(wú)菌水漂洗6次，并于無(wú)菌濾紙上吸干水分，均勻放置在8 g·L-1的水瓊脂培養(yǎng)基中，于25 ℃下避光培養(yǎng)3 ～ 5 d。待種子萌發(fā)后，選取無(wú)污染且長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗備用。

1.3 土壤基質(zhì)的制備與無(wú)菌苗的培養(yǎng)

復(fù)合重金屬污染土壤的制備：將礦渣堆土過(guò)5 mm篩，去除其中的石塊和植物殘?jiān)蠹尤胝渲閹r(土壤∶珍珠巖的體積比為7∶3)，混合均勻后121 ℃滅菌20 min，間歇3次，每次間隔24 h，室溫下冷卻、備用。

不同含量Cd污染土壤的制備：按V加拿大水蘚泥炭∶V珍珠巖= 7∶3制備混合土壤，然后分別加入不同量的氯化鎘，制成Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 、5 、15、30 mg·kg-1的土壤，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，間歇滅菌3次，每次間隔24 h，室溫下冷卻、備用。

將長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗隨機(jī)移栽至不同重金屬污染的土壤中，于室溫下(18 ～ 25 ℃)自然光照培養(yǎng)。

1.4 FXZ2接種劑和滅活劑的制備及接種

在PDA培養(yǎng)基中活化菌株FXZ2后，接種到PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃、130 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d。之后過(guò)濾、取菌絲，轉(zhuǎn)移至500 mL無(wú)菌水中打散制成菌懸液，再將其平均分成2組，一組為FXZ2接種劑，另一組于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min制成FXZ2滅活劑。

將制備好的FXZ2接種劑與滅活劑分別接種到處理組和對(duì)照組幼苗上，每株接種3 mL，使其完全濕透。在第1次接種后的第7 、15、30天再各接種1次，共接種4次。

1.5 植物生理指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 葉綠素含量測(cè)定 在玉米培養(yǎng)37 d后，用葉綠素計(jì)(日本柯尼卡美能達(dá)公司，SPAD-502 Plus)測(cè)定玉米葉片中葉綠素含量[16]。

1.5.2 生物量測(cè)定 培養(yǎng)37 d后，將整株植物自土壤中取出，并在自來(lái)水下沖洗干凈，用無(wú)菌濾紙吸去水分后，測(cè)量株高、根長(zhǎng)和鮮重。之后將植物放入65 ℃烘箱中，烘至恒重并測(cè)量干重。

1.6 植物及土壤中重金屬含量的測(cè)定

1.6.1 植物樣品中重金屬含量的測(cè)定 將烘至恒重的植物樣品分為地上和地下兩個(gè)部分，分別進(jìn)行重金屬含量的測(cè)定[17]。方法如下：將待測(cè)樣品置于研缽中，研磨成粉末。稱取200 mg粉末放入消化管中，加入5 mL HNO3(65 % w/w)浸泡過(guò)夜。隔天將樣本分別在80 ～ 90、100 ～ 110 和100 ～ 110 ℃的消化爐中消解30、30和60 min，消解后冷卻，加入1 mL H2O2(30 % w/w)，再分別于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30和60 min，消解后冷卻，用三蒸水定容至50 mL，通過(guò)火焰原子吸收分光光度法測(cè)定其重金屬含量。

1.6.2 土壤樣品中重金屬含量的測(cè)定 分別取各處理組植物，按照抖根法[18]收集根際土，并于室溫下自然風(fēng)干，用5 mm篩除去土壤中殘留的植物根系，再進(jìn)行研磨，過(guò)100目篩后測(cè)定其重金屬含量[19]：稱取500 mg待測(cè)土壤粉末放入消化管中，加入4 mL HCl-HNO3(3∶1 v/v)混合液浸泡過(guò)夜。隔天將分別在80 ～ 90 、100 ～ 110 和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30 、30和60 min，消解后冷卻，加入1 mL HClO4，再分別于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30和60 min，消解后冷卻，用三蒸水容至50 mL，通過(guò)火焰原子吸收分光光度法測(cè)定其重金屬含量。

Mean ± SE，n=30；*代表處理組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05),下同Mean ± SE，n=30, * indicated that there was significant difference between the experimental group and the control(P<0.05), the same as below圖1 復(fù)合重金屬脅迫下菌株FXZ2對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of FXZ2 on maize growth under multiple-HMs stress

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合重金屬脅迫下內(nèi)生真菌FXZ2對(duì)玉米生長(zhǎng)及重金屬累積的影響

在復(fù)合重金屬脅迫下，接種FXZ2(處理組)的玉米存活率為96.7 %，而接種FXZ2滅活劑(對(duì)照組)的玉米存活率為83.3 %(圖1)。從圖1可以看出，接種菌株FXZ2顯著促進(jìn)了玉米的生長(zhǎng)，處理組玉米的株高、根長(zhǎng)、鮮重和干重均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，分別提高了14.03 %、18.82 %、60.69 %和28.89 %。

在復(fù)合重金屬脅迫下，處理組與對(duì)照組玉米地上部分、地下部分及土壤中Pb、Zn、Cd含量如圖2、圖3～4所示。結(jié)果表明，處理組玉米地上部分Zn、Cd含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，分別降低了7.87 %和8.11 %，Pb含量略低于對(duì)照組但差異并不顯著；相反，處理組玉米地下部分Pb含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，提高了17.57 %，Zn含量高于對(duì)照但差異并不顯著，而Cd含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，降低了4.55 %。處理組根際土壤中Pb、Zn含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，分別降低了8.27 %和16.06 %，而Cd含量高于對(duì)照組但差異并不顯著。

圖2 復(fù)合重金屬脅迫下菌株FXZ2對(duì)玉米地上部分重金屬含量的影響Fig.2 The effect of FXZ2 on aerial parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

圖3 復(fù)合重金屬脅迫下菌株FXZ2對(duì)玉米地下部分重金屬含量的影響Fig.3 The effect of FXZ2 on underground parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

2.2 單一重金屬Cd脅迫下內(nèi)生真菌FXZ2對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響

在單一、不同含量Cd脅迫下，處理組與對(duì)照組玉米的生長(zhǎng)狀況如圖5所示。當(dāng)土壤中Cd含量較高(15和30 mg·kg-1)時(shí)，接種FXZ2顯著促進(jìn)了玉米的生長(zhǎng)，處理組玉米的根長(zhǎng)、鮮重和干重均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，分別提高了52.15 %、79.74 %、72.01 %(15 mg·kg-1)和66.01 %、41.07 %、45.2 %(30 mg·kg-1)，株高略高于對(duì)照組但差異并不顯著。在土壤中低含量Cd脅迫下，情況略有不同：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 mg·kg-1時(shí)，處理組的株高和根長(zhǎng)略高于對(duì)照組，鮮重和干重略低于對(duì)照組；而在Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg·kg-1時(shí)，處理組的鮮重和干重略高于對(duì)照組，株高和根長(zhǎng)略低于對(duì)照組。

圖4 復(fù)合重金屬脅迫下菌株FXZ2對(duì)土壤中重金屬含量的影響Fig.4 The effect of FXZ2 on soils HMs concentration under multiple-HMs stress

圖5 不同含量Cd脅迫下菌株FXZ2對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of FXZ2 on maize growth under different concentration of Cd stress

在單一、不同含量Cd脅迫下，處理組與對(duì)照組玉米葉片中葉綠素含量變化如圖6所示。在無(wú)Cd脅迫條件下(0 mg·kg-1)，處理組玉米葉片中葉綠素含量明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)，降低了20.6 %；而在較高含量Cd脅迫下(30 mg·kg-1)，處理組玉米葉片中葉綠素含量卻明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，提高了12.53 %；而在土壤中Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5和15 mg·kg-1時(shí)，處理組和對(duì)照組玉米葉片中葉綠素含量并無(wú)顯著差異。此外，隨著土壤中重金屬Cd含量的增加，處理組玉米葉片中葉綠素含量總體呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照組并未發(fā)現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。

圖6 不同含量Cd脅迫下菌株FXZ2對(duì)玉米葉片中葉綠素含量的影響Fig.6 The effect of FXZ2 on maize leaves chlorophyll content under different concentration of Cd stress

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在復(fù)合重金屬還是在單一重金屬Cd脅迫下， 接種FXZ2明顯促進(jìn)了玉米的存活和生長(zhǎng)。同樣，劉茂軍[20](2009)也發(fā)現(xiàn)在復(fù)合重金屬或單一重金屬Pb、Zn、Cd脅迫下，接種深色有隔內(nèi)生菌(Dark Septate Endophytic Fungi, DSE)顯著促進(jìn)了玉米的生長(zhǎng)。接種該DSE菌株后，玉米根、莖、葉的生物量均明顯高于對(duì)照。有研究表明，在重金屬Cd脅迫下，DSE影響合成細(xì)胞壁的相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控，激活玉米合成細(xì)胞壁關(guān)鍵酶的活性，改變細(xì)胞壁組分和Cd吸附配位官能團(tuán)的分布，強(qiáng)化細(xì)胞壁對(duì)根系吸收的游離Cd離子的固持與區(qū)室化作用，從而改變Cd離子在玉米根系組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的分布，進(jìn)而限制其向原生質(zhì)體和地上部分的運(yùn)輸，由此減輕Cd對(duì)玉米的毒害[21]。此外，Cd會(huì)影響葉綠素酸酷還原酶的活性，從而抑制植物葉綠素合成，葉綠素含量和光合強(qiáng)度隨Cd含量的上升而下降，且葉綠素a比葉綠素b對(duì)Cd更敏感[22]。玉米葉片中葉綠素含量間接影響到植物的光合作用，研究中發(fā)現(xiàn)隨著Cd含量增加處理組玉米葉片中葉綠素含量總體呈上升趨勢(shì)，而內(nèi)生菌可直接對(duì)植物中葉綠素含量產(chǎn)生直接影響[23]。

在復(fù)合重金屬脅迫下，菌株FXZ2顯著影響了玉米各部位對(duì)重金屬的累積，接種菌株降低了玉米地上部分Zn和Cd的含量，降低了地下部分Cd的含量卻提高了Pb和Zn的含量，降低了土壤中Pb和Zn的含量。有報(bào)道稱，部分真菌可以通過(guò)菌絲、泡囊等結(jié)構(gòu)將過(guò)量的Pb固定在植物根系，影響植物對(duì)Pb的富集特征，顯著降低玉米地上部分Pb含量增加根部Pb含量，有效抑制Pb從根部向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低Pb對(duì)植株地上部分的毒害，減少葉片的自由基積累，維持正常的光合作用[24-25]。此外，真菌與宿主植物形成的共生體可以通過(guò)催化合成植物螯合態(tài)合成酶( PCs) 螯合細(xì)胞質(zhì)中的重金屬離子，并轉(zhuǎn)移至植物液泡來(lái)有效提高植物對(duì)重金屬的耐受性[26]。玉米對(duì)Cd具有較強(qiáng)的吸收和積累能力，玉米吸收Cd后主要積累在根部，對(duì)Cd脅迫下生長(zhǎng)的玉米接種DSE可顯著降低玉米對(duì)Cd的吸收以及Cd在玉米地上部分和根部含量，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是DSE對(duì)Cd在玉米體內(nèi)的化學(xué)形態(tài)和亞細(xì)胞分布產(chǎn)生影響，從而提高了玉米對(duì)Cd的耐性[27]。內(nèi)生菌可以通過(guò)對(duì)重金屬離子的吸收和吸附降低植物體內(nèi)的重金屬脅迫強(qiáng)度，部分內(nèi)生菌可以通過(guò)分泌鐵載體、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)與游離態(tài)的重金屬離子形成絡(luò)合物，減少其向植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移[15]。

重金屬在植物內(nèi)富集和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制與其在植物體內(nèi)的吸收機(jī)制及生物化學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，其中Zn是植物必須的微量元素，植物對(duì)Zn以代謝吸收為主，Pb、Cd是植物非必需的元素，Cd是易積累的有毒元素，為被動(dòng)吸收和代謝吸收，Pb元素為被動(dòng)吸收[28]。接種菌株FXZ2后，玉米對(duì)Pb、Zn、Cd的吸收有所不同，Pb、Zn、Cd在玉米不同部位的含量也存在差異，這可能是FXZ2影響了玉米的某些代謝活動(dòng)所致。如申蜜[21](2017)研究發(fā)現(xiàn)，DSE通過(guò)降低玉米根組織中木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的Cd含量促進(jìn)Cd在根表皮和皮層細(xì)胞的富集，還能顯著增加根細(xì)胞壁果膠和半纖維1對(duì)Cd的富集，減少CW3中Cd含量的比例。土壤性質(zhì)、重金屬離子性質(zhì)及其賦存形態(tài)、以及重金屬離子與其他離子產(chǎn)生的協(xié)同或拮抗作用，均會(huì)影響重金屬?gòu)耐寥老蛴衩椎倪w移[29]。所以弄清在Pb、Zn、Cd脅迫下，菌株FXZ2影響玉米生長(zhǎng)及Pb、Zn、Cd累積的作用機(jī)制，對(duì)闡釋內(nèi)生菌增強(qiáng)宿主植物抗重金屬抗性以及開發(fā)內(nèi)生菌-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤具有重要意義。

4 結(jié) 論

通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重金屬耐受內(nèi)生真菌FXZ2對(duì)玉米在不同重金屬脅迫下的生長(zhǎng)及重金屬累積能力產(chǎn)生顯著影響：在復(fù)合重金屬脅迫下，內(nèi)生真菌FXZ2顯著促進(jìn)了玉米的存活和生長(zhǎng)；在單一重金屬Cd脅迫下，內(nèi)生真菌FXZ2促進(jìn)了玉米在高含量Cd脅迫下的生長(zhǎng)。但內(nèi)生真菌FXZ2對(duì)宿主植物產(chǎn)生影響的作用機(jī)制還有待研究明確。