王曉國，閆海霞，李秀玲，何荊洲，周主貴*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】蘭科菌根(OM)是蘭科植物原球莖或成年植株根部與特定真菌形成的共生體，在自然界中，幾乎所有的蘭科植物均具有菌根，其生長和繁殖過程全部或部分依靠菌根提供養(yǎng)分[1]。1929年，Catoni從蘭科植物中分離到真菌并在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成子實(shí)體，從而極大推動(dòng)了OM真菌的研究[2]。1992年，Currah建立已發(fā)現(xiàn)的OM真菌15屬29種2個(gè)腐生類群的基本檢索表，為OM真菌的分類研究提供了可靠依據(jù)和有效手段[3]。已有研究表明，大多數(shù)OM真菌已得到分離和鑒定，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)已確定OM真菌有5個(gè)類群300余種，隨著檢測技術(shù)和分離方法的改進(jìn)，更多的OM真菌還將會(huì)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[4]。兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個(gè)類群，主要分布于東南亞、南洋群島及太平洋西南大洋洲島嶼國家[5]，因其野生種受到過度采集和自然生境受到嚴(yán)重破壞[6]，分布區(qū)和種群數(shù)量已急劇減少[7]，其全屬植物已被列入“野生動(dòng)植物瀕危物種國際貿(mào)易公約”(CITES)附錄Ⅰ而受到嚴(yán)格保護(hù)[8]。兜蘭在我國主要分布于西南地區(qū)和華南部分地區(qū)[9-10]，廣西西北部是野生帶葉兜蘭(PaphiopedilumhirsutissimumLindl.ex Hook)的主要分布區(qū)域，近年來廣西的野生帶葉兜蘭分布破碎化現(xiàn)象加劇，種群恢復(fù)工作刻不容緩。菌根真菌的篩選和應(yīng)用可提高帶葉兜蘭繁育的成功率，但帶葉兜蘭的菌根真菌種類多而雜，而迄今關(guān)于其OM真菌促生作用的研究較少。因此，鑒定帶葉兜蘭根段分離獲得的OM真菌并分析其促生作用，對帶葉兜蘭種群恢復(fù)和其他種類野生兜蘭的保育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】與蘭科植物形成菌根的真菌多為擔(dān)子菌門的蠟殼菌(Sebacinaceae)、角擔(dān)菌(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌(Tulasnellaceae)和革菌(Thelephoraceae)等專一性較強(qiáng)的真菌[11]，也有一些報(bào)道認(rèn)為銹病菌(Pucciniomycotina)和鐮刀菌(Fusarium)等真菌可與蘭科植物形成菌根[12-13]。此外，OM真菌的群落結(jié)構(gòu)受到多種因素影響，如有些OM真菌存在于干燥的環(huán)境，而其他真菌僅在非本地的種植園內(nèi)存在[14]。不同類型蘭科植物的OM真菌群落也不盡相同，侯天文等[15]研究發(fā)現(xiàn)，同一生境27屬73種附生蘭和地生蘭的OM真菌群落中只有10種同時(shí)存在于附生蘭和地生蘭中。真菌隨著植物生長季節(jié)和營養(yǎng)需求變化呈相似的變化規(guī)律，不同生長時(shí)期的植物需要OM真菌種類不盡相同，其中需求峰值出現(xiàn)在生長期而果期對OM真菌的需求大幅下降[15]。此外，對種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用的OM真菌不一定有利于種子萌發(fā)后植株生長[15-16]，一些植物在種子萌發(fā)時(shí)需要的OM真菌多樣性較成年后的需要更多[17]，而一些在種子萌發(fā)時(shí)需要更多特異性的OM真菌[18]。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對蘭科植物的研究主要集中在其菌根真菌的群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系及種子萌發(fā)方面，鮮見關(guān)于促生真菌篩選研究的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對所收集的野生帶葉兜蘭根段組織分離獲得的OM真菌進(jìn)行形態(tài)觀察和ITS序列分析鑒定，并分析部分真菌的促生作用，以期篩選出可用于兜蘭保育的有效OM真菌，為帶葉兜蘭種群恢復(fù)和自然回歸及其他種類野生兜蘭的保育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生帶葉兜蘭根段樣品于2017年9月采自廣西樂業(yè)縣，收集后裝于自封袋，適量填充原生境苔蘚或腐殖質(zhì)后帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃短期保存。帶葉兜蘭組培苗帶瓶煉苗10 d后移至滅菌基質(zhì)中煉苗3 d，用于開展促生菌株篩選試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 OM真菌分離 采用常規(guī)組織分離法分離OM真菌[13]。對帶葉兜蘭根段進(jìn)行鏡檢，選取具有菌絲團(tuán)的根段，在流水下沖洗干凈，用75 %酒精浸泡8 min進(jìn)行表面消毒后，無菌水沖洗2次，將其浸泡于10 %次氯酸鈉中充分搖動(dòng)消毒8 min，再用無菌水沖洗8次后置于無菌濾紙上吸干表面水分，將根段切成1～2 mm小段后，用滅菌鑷子撕開根皮將外皮層轉(zhuǎn)移并貼在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1000 mL)上，每皿放置2個(gè)根段皮層。取最后1次表面消毒的無菌水洗滌液涂布于PDA平板上檢測有無雜菌污染。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d待菌落長出后，采用尖端菌絲法進(jìn)行菌落分離純化，經(jīng)反復(fù)純化直至得到純化菌落。將純化的菌株分別轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 OM真菌鑒定 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法對帶葉兜蘭菌根真菌進(jìn)行鑒定。在培養(yǎng)過程中，觀察菌株的生長速度、菌落大小、質(zhì)地和邊緣等形態(tài)特征及其孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲體等顯微結(jié)構(gòu)特征，對照相關(guān)資料及《真菌鑒定手冊》初步確定菌根真菌的分類學(xué)地位。同時(shí)將純化后的菌根真菌菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲長滿培養(yǎng)基后，用刀片刮取菌絲，加液氮研磨成粉末后，采用CTAB基因組DNA法提取菌絲基因組DNA。ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系30.0 μl：2×TaqPCR MasterMix 15.0 μl，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μl，模版DNA 1.0 μl，ddH2O 13.0 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果進(jìn)行校對后，通過GenBank的Blast進(jìn)行在線同源性比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果明確帶葉兜蘭菌根的分類地位。

1.2.3 促生作用試驗(yàn) 將準(zhǔn)備篩選的菌株接種到液體PDA培養(yǎng)基中，100 r/min、25 ℃培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)好的菌液離心后收集菌絲并用無菌水清洗，再用無菌水稀釋10倍澆灌。為確保接種成功，在種植帶葉兜蘭組培苗出瓶苗時(shí)用無菌水稀釋的菌液蘸根，然后在接種15和30 d時(shí)再各澆灌1次，每次每株澆灌5 mL，對照組只澆灌無菌水。隨機(jī)將接種后的帶葉兜蘭幼苗擺放在試驗(yàn)大棚中，溫度控制在25 ℃左右，相對濕度為65 %～80 %，光照12 h/d。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30株苗，期間澆水保持基質(zhì)濕潤。

1.2.4 測定項(xiàng)目及指標(biāo) 將初步篩選具有一定促生作用的10株菌株接種至帶葉兜蘭幼苗90 d后，清洗植株上的泥土并用吸水紙吸干植株表面水分，統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)和根數(shù)，使用游標(biāo)卡尺測量葉長和根長，使用分析天平秤量鮮重。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行差異顯著性分析，以Graphpad 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OM真菌的形態(tài)觀察及初步判定

OM的主要特征是在根皮細(xì)胞內(nèi)形成特殊的菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)。帶葉兜蘭的大多數(shù)OM真菌分布在根的外皮層細(xì)胞中，多為致密或疏松的菌絲團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)有菌絲團(tuán)消解形成的針狀結(jié)晶(圖1)。顯微鏡檢測結(jié)果表明，用于組織分離的153個(gè)根段中有143個(gè)根段內(nèi)有OM真菌共生形成的菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)，占總根段數(shù)的93.75 %。

A：根段中的菌絲團(tuán)；B：針狀結(jié)晶；C：致密型菌絲團(tuán)；D：疏松型菌絲團(tuán)A：Hyphae in root；B：Needle-shaped crystal；C：Loose pelotons；D：Dense pelotons圖1 帶葉兜蘭菌根的顯微結(jié)構(gòu)(20×)Fig.1 Microstructure of nutrition root seedling of P. hirsutissimun(20×)

用鑷子撕開根皮，將外皮層貼在培養(yǎng)基上進(jìn)行OM真菌分離培養(yǎng)，共分離出OM真菌134株。依據(jù)菌落形態(tài)、有無孢子產(chǎn)生和菌絲結(jié)構(gòu)等進(jìn)行初步判斷。其中，菌落白色、淡黃色或淡紅色，分生孢子呈長橢圓狀或鐮刀狀的菌株判定為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌，共42株；菌落黑灰色、有同心輪紋，氣生菌絲少、子座球形的為炭球菌屬(Daldinia)真菌，共20株；菌落乳白色，氣生菌絲較多，菌絲成念珠狀或菌絲直角分支的菌株判定為膠膜屬(Tulasnella)真菌，共20株；不產(chǎn)孢或孢子形態(tài)不明確的未知菌根真菌30株(圖2)。此外，仍有22株菌株通過基本形態(tài)只能判定到科水平。因此，依據(jù)形態(tài)特征可將大部分菌株進(jìn)行分類學(xué)初步判定，而小部分菌株的顯微結(jié)構(gòu)極相似，依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定很難確定其歸屬，但其菌落形態(tài)存在明顯差異，可進(jìn)一步進(jìn)行ITS序列比對分析以判定其分類地位。

2.2 OM真菌的鑒定和種類組成

對獲得的OM真菌rDNA ITS序列進(jìn)行比對，序列相同的判定為同一種，序列相似度在98 %以上、菌落形態(tài)和菌絲結(jié)構(gòu)相似的判定為另一種，共得到82個(gè)序列，歸為82種。將上述序列分別與GenBank中公布親緣關(guān)系相近的菌種進(jìn)行Blast在線比對，確定菌株的分類學(xué)地位。結(jié)果(表1)顯示，鑒定的82種菌株可歸為8屬，隸屬于2門5綱5目。其中5屬歸于子囊菌門(Ascomycota)，其余3屬歸于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)；在綱分類水平上，糞殼菌綱 (Sordariomycetes)為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)的31.3 %；在屬水平上以鐮刀菌屬(Fusarium)、炭球菌屬(Daldinia)和膠膜菌屬(Tulasnella)為優(yōu)勢屬，分別占總菌株數(shù)的31.3 %、14.9 %和14.9 %。

表1 帶葉兜蘭OM真菌的類群組成Table 1 The composition of orchid mycorrhizal fungi in roots of P. hirsutissimun

2.3 促生作用分析

將分離得到的134株菌株接種至帶葉兜蘭幼苗(組培苗)進(jìn)行促生菌株初步篩選，結(jié)果有10株菌株表現(xiàn)出一定的促生作用，分別為A-8(鐮刀菌屬)、C-3(炭團(tuán)菌屬)、B-2(膠膜菌屬)、G-6(炭皮菌屬)、A-4(鐮刀菌屬)、A-6(膠膜菌屬)、H-3(膠膜菌屬)、H-2(膠膜菌屬)、A-1(鐮刀菌屬)和A-11(鐮刀菌屬)。采用蘸根法結(jié)合澆灌法將這10株菌株接種至帶葉兜蘭組培苗培養(yǎng)90 d后，僅有4株菌株(A-6、A-8、B-2和C-3)對帶葉兜蘭組培苗的生長指標(biāo)具有顯著(P<0.05，下同)或極顯著(P<0.01，下同)促生作用，其余菌株的促生效果不顯著(P>0.05)(圖3)。其中，膠膜菌屬菌株A-6對帶葉兜蘭幼苗鮮重、葉長、葉數(shù)、根長和根數(shù)的促生作用均極顯著大于CK(分別增大148.20 %、54.15 %、46.18 %、81.25 %和49.03 %)；其次為鐮刀菌屬A-8，對帶葉兜蘭幼苗鮮重、葉長和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大54.18 %、60.38 %和33.65 %)；膠膜菌屬B-2對帶葉兜蘭鮮重、根數(shù)和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大65.53 %、33.41 %和47.81 %)；其后為炭團(tuán)菌屬C-3，對帶葉兜蘭組培苗鮮重和根長的促生作用均極顯著大于CK(分別增大36.05 %和45.93 %)，對葉長的促生作用顯著大于CK (18.11 %)?？梢姡珹-6對帶葉兜蘭組培苗各生長指標(biāo)的促進(jìn)效果最好，A-8對帶葉兜蘭組培苗鮮重和葉長等的促進(jìn)效果較明顯，B-2對帶葉兜蘭組培苗鮮重、根長和根數(shù)等的促進(jìn)效果較佳。說明不同屬菌根真菌菌株對帶葉兜蘭組培苗的促生作用不同，預(yù)示不同屬OM真菌對帶葉兜蘭植株的促生機(jī)制或促生能力存在差異，要實(shí)現(xiàn)利用內(nèi)生菌促進(jìn)帶葉兜蘭植株特定組織生長，必須先有針對性地篩選促進(jìn)該組織生長的特定菌株。

A-1：炭球菌菌落(C-3)；B-1：炭團(tuán)菌菌落(G-6)；C-1：膠膜菌菌落(A-4)；D-1：膠膜菌菌落(H-2)；E-1：膠膜菌菌落(A-6)；F-1：膠膜菌菌落.(B-2)；G-1：鐮刀菌菌落(A-8)；H-1：膠膜菌菌落(H-3)；A-2：炭球菌菌絲(C-3)；B-2：炭團(tuán)菌菌絲(G-6)；C-2：膠膜菌菌絲(A-4)；D-2：膠膜菌菌絲.(H-2)；E-2：膠膜菌菌絲(A-6)；F-2：膠膜菌菌絲.(B-2)；G-2：鐮刀菌孢子(A-8)；H-2：膠膜菌菌絲(H-3)A-1：Colony morphology of Daldinia sp.(C-3)；B-1：Colony morphology of Hypoxylon sp.(G-6) ；C-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(A-4)；D-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(H-2)；E-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(A-6)；F-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(B-2)；G-1：Colony morphology of Fusarium sp.(A-8)；H-1：Colony morphology of Tulasnella sp.(H-3)；A-2：Mycelium morphology of Daldinia sp.(C-3)；B-2：Mycelium morphology of Hypoxylon sp.(G-6) ；C-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(A-4)；D-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(H-2)；E-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(A-6)；F-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(B-2)；G-2：Mycelium morphology of Fusarium sp.(A-8)；H-2：Mycelium morphology of Tulasnella sp.(H-3)圖2 部分帶葉兜蘭菌根真菌的菌落和菌絲形態(tài)Fig.2 The colony and mycelium morphology of some mycorrhizal fungi from P. hirsutissimun

各小圖中圖柱上*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)* on the bar represented significant difference(P< 0.05)，** represented extremely significant difference(P<0.01)圖3 接種不同菌根真菌菌株對帶葉兜蘭幼苗生長指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of incoulation with different mycorihizal fungi strains on the seedling growth of P. hirsutissimun

2.4 菌根真菌rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過序列對比，選擇32株有代表性菌株的rDNA ITS序列與下載的相似性最高的序列進(jìn)行多序列比對，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)，通過Tajima-Nei模塊構(gòu)建聚類樹狀圖(圖4)，處于同一分支的菌株親緣關(guān)系較近，可以判定為同一屬；ITS區(qū)進(jìn)化速度較快，在真菌的屬、種間存在明顯的豐富變異，可用其進(jìn)行屬及以下水平鑒定。

圖4 基于rDNA ITS基因序列的部分菌根真菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi isolated from P. hirsutissimun

3 討 論

蘭科植物在種子萌發(fā)或原球莖發(fā)育期對營養(yǎng)的需求完全依靠真菌，隨著植株的生長，成年蘭科植物植株具有光合作用能力后對OM真菌的依賴逐漸減弱，根中真菌定殖也呈減少趨勢[19]。一些附生蘭和地生蘭對生長環(huán)境要求極為苛刻，其根系主要起固定植株作用，對養(yǎng)分的吸收能力不強(qiáng)，仍需依靠OM真菌提供的氮、磷和水分維持生長[20]。帶葉兜蘭多見于地生或石上浮生，為半附生種類，本研究中的153個(gè)根段均采自石上附生的帶葉兜蘭，其中有93.75 %根段檢測到菌根真菌共生形成的菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)，說明帶葉兜蘭成年植株由于生長環(huán)境的緣故對OM真菌的依賴程度仍較高。

已有研究表明，蘭科植物與特定類群OM真菌發(fā)生的共生關(guān)系并不隨著地理區(qū)域的變化而變化[19]，但是蘭科植物除能與專一的真菌類群形成菌根外，還能與某些真菌類群形成菌根[21]。膠膜菌屬為蘭科植物專一性較強(qiáng)的真菌，均能與杓蘭屬和兜蘭屬的多數(shù)蘭科植物形成OM真菌[5-9]；杏黃兜蘭和硬葉兜蘭菌根中分離到真菌類群的鐮刀菌為優(yōu)勢菌群[22-23]；Rasmussen[4]也將鐮刀菌屬歸為OM真菌。本研究從帶葉兜蘭根段中分離到134株OM真菌，歸屬于82種8屬，其中鐮刀菌屬、碳球菌屬和膠膜菌屬為優(yōu)勢菌屬，表明本研究分離到的鐮刀菌屬真菌為帶葉兜蘭的OM真菌。

不同生長階段帶葉兜蘭植株體內(nèi)的OM真菌種類和組成通常存在明顯差異，從成年植株上分離到的OM真菌不一定能促進(jìn)種子萌發(fā)，能促進(jìn)種子萌發(fā)的真菌也不一定具有促生作用[24]。有些真菌即使能形成共生菌根，也不具有促進(jìn)種子萌發(fā)或促進(jìn)植株生長的作用[25]。本研究中，僅有少數(shù)菌根真菌對帶葉兜蘭組培苗具有顯著促生作用，其中膠膜菌屬真菌A-6對帶葉兜蘭組培苗的促生作用最大，其余膠膜菌屬真菌均無顯著促生作用，而無顯著促生作用的膠膜菌屬真菌是否在一些極端環(huán)境條件下產(chǎn)生保護(hù)植株或促進(jìn)種子萌發(fā)的作用，有待進(jìn)一步探究。此外，鐮刀菌屬真菌A-8也可促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長，與陳娟等[26]研究認(rèn)為鐮刀菌可促進(jìn)杏黃兜蘭生長、Jiang等[27]研究認(rèn)為鐮刀菌對黃花白芨也有促生作用的觀點(diǎn)一致，說明鐮刀菌對蘭科植物的促生作用較普遍；炭團(tuán)菌屬C-3對帶葉兜蘭生長也具有促進(jìn)作用，然而目前鮮見此類真菌可促進(jìn)其他蘭科植物生長的研究報(bào)道，因此，其形成菌根后仍需進(jìn)行再分離以確定其為OM真菌或能分解木質(zhì)纖維以利于帶葉兜蘭生長。

4 結(jié) 論

帶葉兜蘭根段多數(shù)定殖有OM真菌，其中的鐮刀菌屬、炭團(tuán)菌屬和膠膜菌屬為優(yōu)勢菌屬。膠膜菌屬菌株A-6對帶葉兜蘭組培苗的促生效果最佳，鐮刀菌屬菌株A-8次之，膠膜菌屬菌株B-2和炭團(tuán)菌屬菌株C-3的促生效果也較明顯，這些菌株可作為保育和人工栽培帶葉兜蘭的菌種資源儲(chǔ)備。