陳旭玉，趙祥升，劉小敏，楊美華,2*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點實驗室，海南 ?？?570311；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193)

【研究意義】中藥材在種植、采收、加工和貯藏的過程中容易受到外源真菌的污染，特別是在貯藏條件不當(dāng)?shù)臈l件下容易引發(fā)霉變，霉變后的藥材容易產(chǎn)生真菌毒素，影響中藥材質(zhì)量及藥品的安全[1]。其中危害最大的真菌毒素有黃曲霉毒素(Aflatoxin)，赭曲霉毒素(Ochratoxin A)，伏馬毒素(Fumonisins)等。曲霉屬是污染中藥材的主要優(yōu)勢菌群之一，曲霉屬真菌產(chǎn)生的真菌毒素能引發(fā)肝毒性、腎毒性等重大毒性反應(yīng)，嚴(yán)重威脅了消費者生命健康。【前人研究進(jìn)展】黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益氣補(bǔ)中，生津養(yǎng)血的作用，為常用的補(bǔ)氣中藥，用于脾肺虛弱，氣短心悸，虛喘咳嗽等[2]。另外，黨參還具有鎮(zhèn)靜解熱、降血壓、降血糖、保肝、抗疲勞和抗腫瘤等作用[3]。黨參屬于根類藥材，易受真菌毒素污染。王文麗[4]年從黨參表面分離到刺孢曲霉A.aculeatus并檢測到赭曲霉毒素A (OTA),蘇春燕等[5]研究黨參的真菌總數(shù)高于三七和柴胡，且曲霉數(shù)高于青霉數(shù)。因此，黨參外源真菌污染不可忽視?！颈狙芯壳腥朦c】黨參的外源真菌主要有哪些組成，除了報道的黨參有赭曲霉毒素A的污染外，是否存在其他毒素的污染，以此為切入點進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過分析云南、河北、江西、重慶、廣西、甘肅地區(qū)黨參外源真菌，初步明確外源污染菌的種類及主要的產(chǎn)毒真菌，為防治黨參外源污染真菌的防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分別從廣西、江西、云南、甘肅、河北、重慶的藥材市場購買黨參。分裝入無菌塑料袋內(nèi)，帶回實驗室，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所資源中心朱平主任鑒定為黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.。

1.2 方法

1.2.1 藥材表面真菌分離 稱取10 g 黨參，加入90 mL 無菌水和20顆玻璃珠的三角瓶中，置于恒溫?fù)u床中130 r/min室溫震蕩20 min，靜置5 min，取上清液為10-1菌懸液，依次稀釋成不同濃度，取0.5 mL均勻涂布至直徑為90 cm的含有氯霉素的麥芽提取物瓊脂Malt Extract Agar (MEA)培養(yǎng)皿中，放置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d(n=5)，計算菌落數(shù)，體視鏡單孢分離進(jìn)行純化[6]。

1.2.2 菌株鑒定 將純化的菌株在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(25 ℃)。用無菌接種針從真菌菌落邊緣處挑取一小塊產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，放置在載玻片上，加棉蘭染液，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察形態(tài)。隨后根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定的初步結(jié)果，提取真菌DNA，青霉屬和曲霉屬真菌采用通用引物β-tublin，其他絲狀真菌采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增，ITS反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。β-tublin反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。所獲得的PCR產(chǎn)物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，測定的序列通過NCBI Blast軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.3 產(chǎn)毒真菌菌株檢測 將待測樣品活化后，挑取少量菌絲于MEA液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)7 d (25 ℃，120 r/min)。加入甲醇 (甲醇與樣品量的比為2∶1)，渦旋5 min，靜置20 min，取100 μl上清液置于離心管中，加入700 μl樣品稀釋液混合均勻，此為待測液。吸取100 μl待測液滴加到金標(biāo)微孔中，然后用滴管吹打金標(biāo)微孔中的溶液，直至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解,指示結(jié)果與說明書比對，陽性樣品采用UPLC-MS/MS確認(rèn)。將培養(yǎng)7 d (25 ℃，120 r/min)的菌液，通過多功能凈化柱處理，然后通過0.2 μl的濾紙過濾，然后上液相。UPLC-MS/MS條件：色譜柱：BEH C18(100 mm × 2.1 mm i.d., 1.7 μm, Waters Corp.)，柱溫：35 ℃；流動相：2 mM乙酸銨水溶液 (A)-甲醇 (B，含-0.1 %甲酸)，梯度洗脫：0 min: 25 % A; 2 min: 45 % A; 10 min: 90 % A; 12 min: 90 % A; 12.1 min: 25 %，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μl。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI), 正離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測 (Multiple reaction monitoring，MRM)掃描，毛細(xì)管電壓2.5 Kv；離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度350 ℃，目標(biāo)物的質(zhì)譜條件見表1[7]。

表1 黃曲霉毒素質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions for aflatoxin detection

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參外源污染真菌的分離

由表2顯示，從廣西、江西、云南、甘肅、河北、重慶的6個不同地區(qū)的黨參表面共分離得到79株外源真菌，其中曲霉屬Aspergillus34株，青霉屬Penicillium30株、鏈孢霉屬Neurospora10株，擬青霉屬Paecilomyces4株，說明青霉屬和曲霉屬為黨參的外源優(yōu)勢種群。

表2 6個地區(qū)黨參外源真菌的分離和鑒定Table 2 Isolation and identification of exogenous fungi from C. pilosula in six regions

黨參外源分離的曲霉屬有塔賓曲霉A.tubingensis17株，煙曲霉A.fumigatus11株，黃曲霉A.flavus4株，棘孢曲霉A.aculeatus1株，黑曲霉A.niger1株，橘青霉P.citrinum21株和草酸青霉P.oxalicum9株。曲霉屬中主要是以塔賓曲霉和煙曲霉為主，青霉主要是以橘青霉為主。

根據(jù)不同地區(qū)來源分析，廣西黨參共分離了28株，以橘青霉P.citrinum為優(yōu)勢菌，云南黨參共分離了11株，以煙曲霉A.fumigatus為優(yōu)勢菌；河北黨參共分離18株，以草酸青霉P.oxalicum為優(yōu)勢菌；江西黨參共分離9株，以鏈孢霉菌Neurosporasp.為優(yōu)勢菌；重慶和甘肅黨參分別分離5和8株，以塔賓曲霉A.tubingensis為優(yōu)勢菌；說明不同地區(qū)黨參的表面污染真菌數(shù)量及種類存在差異。

2.2 黃曲霉毒素的產(chǎn)毒種類確定

檢測到的陽性樣品再次通過UPLC-MS/MS檢測，圖1-A為黃曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG2和AFG2標(biāo)準(zhǔn)品(26 ng/mL), 圖1-B為黃曲霉GXDC1-5產(chǎn)生AFB1；圖1-C黃曲霉 HBDC1-5產(chǎn)生AFB1和AFB2；圖1-D黃曲霉YNDC1-5產(chǎn)生AFB1、AFB2和AFG2。不同的黃曲霉種產(chǎn)生的毒素種類不一樣。

2.3 黃曲霉毒素含量的測定

真菌在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，其菌液凈化后檢測，其中黃曲霉GXDC1-5產(chǎn)生AFB1，濃度為11.91 ng/mL；黃曲霉HBDC1-5中產(chǎn)生AFB1和AFB2，濃度分別為9.28和1.53 ng/mL；黃曲霉YNDC1-5產(chǎn)生AFB1、AFB2和AFG2，濃度分別為76.09、2.36和1.49 ng/mL (表3)，說明不同的真菌產(chǎn)生毒素類型及能力有差別。

表3 不同黃曲霉產(chǎn)生毒素的結(jié)果Table 3 The results of the production of toxins by A. flavus

A: 黃曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG1 和 AFG2標(biāo)準(zhǔn)濃度的色譜圖；B, C和D: 分別為黃曲霉GXDC1-5，HBDC1-5 和 YNDC1-5產(chǎn)生黃曲霉毒素的色譜圖A: Chromatogram of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 standard concentration；B, C and D: Chromatogram of AFTs produce by A. flavus GXDC1-5，HBDC1-5 and YNDC1-5,respectively圖1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品和黃曲霉產(chǎn)生毒素的色譜圖Fig.1 Chromatogram of AFTs standard concentration and the AFTs produce by A. flavus

3 討 論

真菌在自然界中分布廣泛，在中藥材中造成污染的情況非常普遍，不同地區(qū)因生態(tài)條件差異，所銷售的不同種類藥材受到污染性真菌的類群也有所不同。蔡飛對5個地區(qū)的甘草進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)曲霉和青霉是霉變甘草的主要污染菌[6]。宋美芳等[8]研究昆明和玉溪地區(qū)絞股藍(lán)發(fā)現(xiàn)其主要污染菌為曲霉屬真菌。宋美芳等[9]報道三七污染真菌以淡紫擬青霉和橘青霉為優(yōu)勢菌；草果污染菌以淡紫擬青霉和黃曲霉為優(yōu)勢菌, 腎茶上的淡紫擬青霉和茄病鐮刀菌隨貯藏期的延長而增加，并有黃曲霉出現(xiàn)。陳娟[10]對藥材市場上霉變甘草的污染真菌分析發(fā)現(xiàn)青霉(P.polonicum和P.crustosum)和曲霉(A.parasiticus)為優(yōu)勢真菌。陳娟[11]等對7種根類藥材(甘草，巴戟天，黃芩，白術(shù)，三七，當(dāng)歸)污染真菌的分析發(fā)現(xiàn)青霉屬真菌為主要污染真菌。本文分析黨參外源污染真菌主要是青霉Penicillium和曲霉Aspergillus?？梢娭兴幉牡耐庠次廴疚镏饕郧嗝购颓篂橹鳌?/p>

本研究從黨參中分離得到的真菌有：塔賓曲霉A.tubingensis，煙曲霉A.fumigatus，黃曲霉A.flavus，棘孢曲霉A.aculeatus，黑曲霉A.niger，橘青霉P.citrinum，草酸青霉P.oxalicum，鏈孢霉菌Neurospora等,其中云南地區(qū)、重慶地區(qū)和甘肅地區(qū)黨參的外源污染真菌以曲霉屬Aspergillus為優(yōu)勢菌，河北地區(qū)和廣西地區(qū)黨參外源真菌以青霉屬Penicillium為優(yōu)勢菌，江西黨參的外源真菌以鏈格孢為主，說明不同地區(qū)其外源真菌的種類及數(shù)量有差異。P.citrinum能夠產(chǎn)生橘青霉素[12]，但在分離的橘青霉中沒有檢測到。黃曲霉毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生[13-14]，本研究共分離出4株黃曲霉，有3株產(chǎn)生毒素，說明黃曲霉中產(chǎn)生黃曲霉毒素的概率很大。

大量研究表明中藥材中AFTS、OTA、FB、ZEA等真菌毒素的污染率較高，有的存在多種毒素污染的情況[15]。王文麗[4]年從黨參表面分離到刺孢曲霉A.aculeatus并檢測到赭曲霉毒素A (OTA)，本文從黨參表面分離了3株黃曲霉，檢測到黃曲霉毒素。黨參中是否存在其他毒素有待下一步的研究。