薛蓮芳, 劉慧, 丘穗珊, 朱勤愛, 王玉平, 羅惠娟

(暨南大學附屬第一醫(yī)院 1.藥學部, 2.臨床醫(yī)學檢驗中心, 3.產科， 廣東 廣州 510630)

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期常見的嚴重并發(fā)癥.臨床表現為孕婦血清膽汁酸濃度顯著增加，伴或不伴轉氨酶、膽紅素升高[1-2].病因學研究發(fā)現該病與遺傳和雌激素過高有關，可導致早產、胎兒宮內窘迫和胎死宮內等.目前常用的治療有腺苷蛋氨酸和熊去氧膽酸，還可以輔助一些利膽退黃的中藥，但仍有一部分患者治療效果不好，需要提前終止妊娠或發(fā)生嚴重胎兒、新生兒并發(fā)癥.

穿心蓮[Andrographispaniculata(Burm. F.)Nees]為爵床科植物，別名一見喜、斬蛇草及苦膽草等[3].其原產于印度半島和斯里蘭卡，在東南亞國家具有悠久的民間用藥歷史，是最具代表性的“大南藥”之一[4].穿心蓮性味苦寒，有抗菌消炎、清熱解毒及消腫止痛等功效，是清火梔子麥片、消炎利膽片、穿心蓮內酯片及蓮必治注射液等多種中藥制劑的主要原料，可用于呼吸道感染、腸胃炎、高血壓、瘧疾、毒蛇咬傷、糖尿病及高血壓等疾病的臨床治療，有“中藥抗生素”之稱[5-6].穿心蓮主要藥用成分為烷型二萜類化合物，如穿心蓮內酯(andrographolide，AD)、新穿心蓮內酯(neoandrographolide，NAD)、14-脫氧穿心蓮內酯(14-deoxyandrographolide，14DAP)及脫水穿心蓮內酯(dehydroandrographolide，DDAD)等[7].

本文通過網絡藥理學方法首次對穿心蓮治療ICP的分子機制進行了全面系統(tǒng)的解析，網絡藥理學方法可通過整合多種生物數據庫，構建“成分-疾病-靶點-通路”的互作網絡，探究中藥成分對于疾病的主要分子作用機制與信號通路，是目前探索中藥方劑藥理機制的綜合有效的方法.另外，本研究通過建立ICP大鼠動物模型，給予模型鼠AD治療，觀察AD對ICP的治療效果，進一步闡述穿心蓮治療ICP的分子機制，探究其對關鍵靶點的作用，為臨床藥物的開發(fā)和臨床應用提供依據.

1 材料與方法

1.1 穿心蓮化學成分及其靶點的預測

以“穿心蓮”為關鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)進行檢索，得到穿心蓮的主要化學成分.根據藥物篩選中最常用的兩種藥代動力學特性進行篩選：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18，從而獲得穿心蓮中具有較高活性的潛在有效化學成分.

1.2 靶點的篩選

GeneCards (https://www.genecards.org/)是一個集成大量web源的以基因為中心的數據庫，能解釋并預測人類基因信息.以妊娠期肝內膽汁淤積癥“Intrahepatic cholestasis of pregnancy”為關鍵詞，在GeneCards數據庫查找疾病相關靶點.通過Comparative Toxicogenomics Database(http://ctd.mdibl.org/)數據庫中MyVeny功能，繪制穿心蓮成分靶點與疾病靶點匹配映射的韋恩圖，獲得穿心蓮治療ICP的潛在靶點.

1.3 PPI圖制作

將藥物作用靶點和疾病靶點的交集輸入到STRING數據庫，種屬選擇“Homo sapiens”，獲取公共靶點的相互作用網絡圖(PPI)，并進行拓撲學分析，導出string.interactions.tsv文件.

1.4 功能和通路富集分析

利用Bioconductor平臺和R語言對獲得的基因進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析.首先進行R 語言安裝包的安裝，包括DOSE，clusterProfiler，enrichplot，colorspace，stringi，ggplot2，pathview軟件包，分別導出GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析表格，將分析結果的前20 條進行可視化.

1.5 試劑與儀器

SD大鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(粵)2017-0125]；苯甲酸雌二醇(批號K1617016)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大豆油(批號D1515001)購自aladdin公司(批號D1515001)；氯化鈉注射液(批號1907172727)購自辰欣藥業(yè)有限公司；促凝管(批號190309)購自瀏陽市三力醫(yī)藥科技有限公司，離心機(TDL- 40B)購自上海安亭科學儀器廠(TDL- 40B)，全自動生化分析儀(型號7600)購自日立公司.

1.6 動物實驗

SD大鼠雌性70只，雄性35只，體質量(220.3±13.5)g,自由飲水與飼料，發(fā)情期雌性和雄性大鼠按2∶1合籠.交配后以陰道拭子見精子即妊娠第0天為標準判斷妊娠成功，選取其中50只成功受孕雌鼠實驗.妊娠后第10天，隨機將50只雌鼠分5組(空白組，模型對照組和高、中、低劑量治療組)，每組10只.根據文獻[8]對模型對照組和治療組進行造模.常規(guī)喂養(yǎng)至妊娠第10天，除空白對照組外，其他各組自大鼠頸背部皮下注射質量分數3 mg/kg苯甲酸雌二醇. 取適量穿心蓮內脂溶解于大豆油中配置質量濃度5 mg/mL的備用藥液，治療組大鼠按照體質量計算給藥體積后每天分別灌胃穿心蓮內脂溶液(高劑量組80 mg/kg，中劑量組40 mg/kg，低劑量組20 mg/kg).模型組灌胃氯化鈉注射液2 mL；妊娠第17天，大鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血3～5 mL，置于促凝管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液，交檢驗科測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，谷草轉氨酶谷草轉氨酶(AST)，總膽汁酸(TBA)，膽紅素(TBIL)水平[1-2].孕鼠取血后，取胎，記錄活胎鼠數，死胎數量，胎鼠體質量.

2 結果

2.1 穿心蓮候選化合物及靶點篩選

在TCMSP 數據庫中，檢索中藥“穿心蓮”得到化學成分49個，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件，篩選出穿心蓮潛在活性化合物24個，主要包括穿心蓮黃酮、穿心蓮內酯、漢黃芩素和穿心蓮黃酮甙 F、14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯等組分(表1)，共預測靶標65個.

表1 穿心蓮的活性成分及參數Table 1 The active ingredients of Andrographis paniculata

2.2 藥物與疾病相交的靶點

通過Gene Cards數據庫共檢索出984個疾病相關靶點.將穿心蓮潛在作用靶點映射到獲得的疾病相關靶點中，共獲得30個相交靶點，制成韋恩圖(圖1).從側面佐證了穿心蓮治療該疾病的科學性和有效性.

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡模型的構建及分析

將穿心蓮的24個活性成分與30個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖(圖2).結果涉及21個成分(3個活性成分靶點與疾病靶點無交集，故刪除)和30個藥物-疾病共同靶點，充分體現了穿心蓮多成分、多靶點治療ICP的作用.

圖1 韋恩圖

圖2 有效成分-靶點網絡圖

2.4 PPI網絡構建

將30個靶蛋白輸入到STRING數據庫獲得PPI網絡圖(圖3).該網絡共有30個節(jié)點，共185個相互作用關系線，平均度值為12.3.

圖3 PPI網絡圖

2.5 靶點功能及通路富集分析

基于穿心蓮治療ICP交集網絡共篩選到30個靶點基因進行富集分析，根據P值，排前20的顯著富集GO 功能和KEGG 代謝通路如圖4.其中GO 富集分析涉及生物學過程(biological process)、分子功能(molecularfunction) 和細胞組成(cellular component) 等3個水平.共同作用靶點在生物過程(BP)中，主要富集條目多為對類固醇激素的反應、DNA模板化的轉錄起始、氧化應激反應(圖4).共同作用的靶點在細胞組成(CC)中主要富集條目為周期蛋白依賴蛋白激酶全酶復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白激酶復雜(圖5).共同靶點在分子功能(MF)中主要富集的條目為類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子的活性, 泛素蛋白連接酶結合(圖6).KEGG 富集分析結果顯示如圖7所示，共同靶點主要富集于PI3K-Akt信號通路、小細胞肺癌通路、乙型肝炎通路.

圖4 生物學過程圖

2.6 實驗驗證

2.6.1 各組孕鼠體內血液生化指標比較

血清標本經血液生化分析儀檢測TBIL，ALT，AST，TBA值見表2.與空白對照組比較，其他各組生化指標均顯著增高(P<0.05)，顯示苯甲酸雌二醇造模效果好、成功率高.除低劑量組，其他各組與模型對照組比較各指標均有顯著性差異(P<0.05)，中、高劑量治療組各項指標與模型對照組比較均明顯下降(P<0.05)，高劑量組改善尤其明顯.

圖6 分子功能圖

圖7 KEGG圖

表2 各組孕鼠體內血液生化指標比較Table 2 Comparison of blood biochemical indexes in pregnant rats of each group

2.6.2 各組胎鼠數量與質量比較

空白組胎鼠全部存活，無死胎，平均質量最大，各項指標均明顯優(yōu)于其他各組.低劑量組在各項指標上與模型組均無顯著差異.觀察活胎鼠數，高劑量組比中、低、模型對照組均具有顯著提高，中劑量組在這個指標上對比低、模型組又有明顯改善.觀察死胎數量，中、低、模型組3組間無顯著差異，高劑量組死胎數量明顯高于其他各組.觀察胎鼠平均質量，高劑量組質量明顯大于中、低、模型對照組，而中劑量組對比低、模型組又有明顯提高.

表3 各組胎鼠數量與質量比較Table 3 Quantity and quality of fetal rats in each group were compared

3 討論

目前ICP的發(fā)病機制尚不明確，可能與多種因素有關，其中高激素水平是導致ICP發(fā)生的重要原因之一.研究顯示雌激素在ICP 的發(fā)病過程中風險系數較高，起著重要的作用，ICP孕婦體內的雌激素水平如果快速提升可引起肝細胞酶水平異常，這會降低膽鹽的代謝能力，從而誘發(fā)瘙癢、黃疸、尿酸高等癥狀[9-10].本次實驗根據文獻使用苯甲酸雌二醇成功誘導孕鼠ICP發(fā)生，孕鼠體內血液生化指標均顯著高于空白對照組，顯示該造模效果明顯，成功率高.ICP治療常用的藥物有腺苷蛋氨酸和熊去氧膽酸[11]，可以輔助一些利膽退黃的中藥，但仍有一部分患者無效或病情反復，需要提前終止妊娠或發(fā)生胎兒、新生兒嚴重并發(fā)癥.

利用純天然植物或動物中提取的有效成分診治疾病，已成為現代醫(yī)學的發(fā)展熱點.爵床科植物穿心蓮應用于炎癥相關性疾病已有上百年歷史，明確、安全、有效的治療效果使其受到廣泛關注，隨著對穿心蓮的研究深入，它所顯現的廣泛的生理活性及防治心血管疾病、抗腫瘤、保肝利膽、增強免疫等多重功效, 使其成為一種很有前途的中藥, 值得進一步研究和開發(fā).近十幾年的研究發(fā)現，AD對于重癥感染、酒精、有毒化合物導致的肝損傷均有明顯的治療作用[12-14].對膽汁淤積誘導肝纖維化具有保護作用[15]，AD可以有效地降低膽汁酸水平，增加實驗大鼠、豚鼠的膽汁流量、膽鹽、膽酸和去氧膽酸量，改善肝功能[16]，與其他降膽酸的藥物不同的是，AD還有抗病毒的作用[17-18]，這對于大量合并乙肝病毒攜帶的ICP患者無疑是一個可能更好的選擇.

本實驗結果表明，高、中劑量治療組使用AD后對TBIL，ALT,AST,TBA值均有一定改善作用，且高劑量組對TBA值降低作用十分明顯，說明穿心蓮內酯對ICP具有治療作用，且呈現劑量依賴關系.低劑量治療組對ICP未顯示明顯治療作用，說明本實驗使用的高、中劑量組的穿心蓮內酯雖對ICP有明顯療效，但未能完全消除ICP過程中TBA值的上升現象，可能需要增加藥量或延長療程.除TBA外，ALT， AST，TBIL 3個指標也是ICP患者常見的異常指標[19]，本研究中該3個生化指標也根據實驗條件變化而發(fā)生相應改變，模型組在苯甲酸雌二醇的刺激下3個指標均大幅增長，但可以被高、中劑量AD緩解.穿心蓮內脂對膽汁酸和肝功能的改善效果說明其對ICP具有一定的治療潛能.

ICP發(fā)生時會導致血清膽汁酸水平增加并通過胎盤運輸到胎兒，導致胎兒受到嚴重損傷.此時因為孕婦自身膽酸水平顯著升高，胎盤絨毛膜間隙受此作用會顯著縮小，導致流入胎盤中的血流量降低，影響胎盤正常血液灌注.再加上膽酸的血管收縮作用，所以圍產期胎兒很容易缺血缺氧，發(fā)生窘迫或死胎[20-21].本研究發(fā)現模型組胎鼠數量與體質量均顯著低于空白對照組，說明胎鼠受到母體ICP影響，數量與體質量均下降.給藥后發(fā)現高、中劑量治療組在胎鼠數量與質量方面均有一定改善，且死胎數量也少于模型組與低劑量治療組，但與空白組比還有一定差距.說明實驗劑量的AGL在一定程度上可以緩解ICP，但沒有完全改善不良預后.此外，雖然高劑量組在死胎數量上明顯高于其他各組，但活胎數也明顯多于模型對照組和中、低劑量治療組，因此高劑量治療組的胎兒死亡率(36.59%)仍然低于中劑量組(39.56%).

AD在妊娠期使用的安全性存在爭議，使它在臨床上的使用受到限制.既往報道，中藥穿心蓮具有明顯抗早孕效果.動物實驗中顯示對不同妊娠期的小鼠都有明顯的終止妊娠作用，作用機理與抗孕酮抵抗有關，因此認為外源性孕酮有明顯的防止穿心蓮早期流產的作用[22].有學者研究穿心蓮提取物對大鼠血孕酮水平的影響，在懷孕的第19天給予200、600和2 000 mg/kg的劑量，發(fā)現對大鼠血漿中孕酮水平的升高沒有任何影響.因此認為在有效治療劑量下，穿心蓮提取物不會誘導孕酮介導的終止妊娠[23].研究還發(fā)現AD還能抑制子宮腺肌癥患者子宮肌層的催產素受體(OTR)的表達，從而抑制子宮收縮，達到止痛目的[24-25]，因此AD在晚孕期使用的安全性目前還沒有確定.本實驗發(fā)現，模型對照組死胎率最高，治療組死胎率都有不同程度的下降，尤其高劑量治療組，可見AD在孕晚期大鼠的使用并未增加死胎的發(fā)生，可能由于血清膽汁酸水平仍未恢復正常，所以還會導致一些胎鼠的死亡.

綜上所述，AD對ICP大鼠模型具有一定治療效果，對血液生化指標有明顯改善作用，對胎鼠的數量和質量均具有一定保護作用，值得進一步研究，具有一定臨床應用可能.