方練，陳霖，林碧

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015；1.耳鼻咽喉科；2.病理科

中耳膽脂瘤是顳骨內(nèi)角質(zhì)化細胞異常增生性病變，是上皮細胞強烈增殖、角蛋白碎屑大量堆積形成的上皮樣囊袋[1-2]，膽脂瘤侵襲性生長可破壞周圍骨質(zhì)，導致各種顱內(nèi)外并發(fā)癥，如迷路炎、周圍性面癱和腦膿腫等[3-4]。膽脂瘤中的免疫細胞釋放炎癥遞質(zhì)，導致咽鼓管功能障礙和中耳黏膜纖毛清除功能減退，中耳細菌產(chǎn)物堆積，造成感染的惡性循環(huán)。膽脂瘤的異常增殖可能與過度炎癥有關，其具體分子機制目前尚不明確。

巨噬細胞是機體免疫的關鍵組成部分，能夠辨認共生抗原，清除病原體和代謝物，維持組織穩(wěn)態(tài)，如果這一過程被破壞，將產(chǎn)生過度的免疫反應，促進組織炎癥的發(fā)生和發(fā)展，可能導致上皮增殖失控和膽脂瘤生成[5]。

不同部位的巨噬細胞具有轉(zhuǎn)錄和功能差異，并由其基因表達譜所決定[6]。本研究通過RNA-Seq方法[7]檢測中耳膽脂瘤巨噬細胞的基因表達譜，篩選出差異表達基因，探討其在中耳膽脂瘤中的生物學功能及信號通路。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1月至12月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科行乳突切除術的慢性化膿性中耳炎患者共57例，經(jīng)手術探查及HE染色病理檢查，其中12例為中耳膽脂瘤，45例為非膽脂瘤型中耳炎。術中分別收集中耳膽脂瘤患者的膽脂瘤基質(zhì)周圍組織和非膽脂瘤型中耳炎患者的中耳肉芽組織。隨機抽取3例中耳膽脂瘤標本為試驗組，3例非膽脂瘤型中耳炎標本為對照組。

1.2 方法

1.2.1 組織巨噬細胞分離：將收集的標本組織切成小塊，在37 ℃ Hank’s液中孵化30 min。用細胞濾網(wǎng)采取吸液和機械分離的方式得到單細胞懸液。用抗人CD14免疫磁珠抗體（購自美國BD公司） 標記巨噬細胞，置于BD IMag的磁場中，CD14+細胞因向磁體遷移而得以分離，重復分離2次后用流式細胞儀檢測CD14+細胞的百分比。

1.2.2 總RNA提取、文庫構建：用Hank’s液調(diào)整細胞懸液濃度至105～106/mL，使用總RNA提取試劑盒（購自南京諾維贊生物科技有限公司）從每個樣本中提取總RNA，使用RNA-Seq文庫制備試劑盒（購自南京諾維贊生物科技有限公司），用磁珠捕獲并片段化mRNA，隨機引物合成cDNA第一鏈，修復cDNA末端，將Illumina接頭連接到cDNA，選取cDNA 200～300 bp片段進行PCR擴增，PCR循環(huán)數(shù)在12～17次之間，獲得大約2 μg的PCR產(chǎn)物，用DNA清潔珠純化PCR產(chǎn)物，于-70 ℃冰箱保存。

1.2.3 測序分析：通過Illumina平臺對cDNA進行測序，每個樣本獲得平均5 000萬個150 bp片段的原始數(shù)據(jù)。對原始數(shù)據(jù)進行過濾和質(zhì)量檢查，轉(zhuǎn)換成有效讀段，映射到人類參考基因組，組裝轉(zhuǎn)錄本并計算基因讀數(shù)。對讀數(shù)進行標準化，以每千堿基對百萬片段（FPKM）代表基因表達水平[8]。

1.3 結(jié)果分析

1.3.1 全基因組差異表達分析：基于FPKM的差異倍數(shù)對數(shù)值（log2FC），比較兩組間基因的表達水平，P＜0.05被篩選為差異基因。用Pheatmap軟件繪制基因表達熱圖，按基因表達量排序，對差異表達基因進行基因本體論（gene ontology，GO）分析，按分子功能、細胞成分和生物學過程分為三個層次。利用cluster Profiler軟件對差異表達基因的信號通路進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析[9]。按基因表達量排序，生成一個矩陣，用基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）方法對兩組基因進行全面比較[10]。再通過Cytoscape軟件[11]繪制GO相互作用網(wǎng)絡圖[12]，可視化GSEA結(jié)果，去除冗余信息，獲得清晰結(jié)果。

1.3.2 RT-PCR和qPCR驗證：采用RT-PCR法對差異表達量靠前的5個基因進行驗證，總RNA分離、cDNA第一鏈合成和q PCR（熒光定量試劑盒購自日本Takara 公司）的實驗步驟按產(chǎn)品說明書進行。在PCR儀上進行35次循環(huán)，采用2ΔΔCt計算法，標準化數(shù)值，GAPDH為引物的參考基因[13]。

2 結(jié)果

2.1 熱圖分析 根據(jù)熱圖顯示，在表達量大于1 FPKM的5 342個基因中，124個基因顯示表達明顯上調(diào)（P＜0.05）。表達上調(diào)排前的基因包括肌蛋白（musculin，MSC）、IgA受體Fc片段（Fc fragment of IgA receptor，F(xiàn)CAR）、受體A5樣白細胞免疫球蛋白（leukocyte immunoglobulin like receptor A5，LILRA5）和基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloperptidase 7，MMP-7）等，見圖1。此外，有66個基因顯示表達明顯下調(diào)（P＜0.05，見圖2）。

2.2 功能分析 為了研究差異基因是否參與中耳膽脂瘤的發(fā)病過程，對表達上調(diào)基因進行GO功能注釋，將它們分為41組（P＜0.01，見表1、圖3）。通過GSEA和GO相互作用分析，發(fā)現(xiàn)差異基因的功能主要集中于B細胞和T細胞免疫、中性粒細胞功能和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinases，ERK）信號的負調(diào)控等。

圖1 熱圖顯示中耳膽脂瘤巨噬細胞內(nèi)124個表達上調(diào)基因

圖2 熱圖顯示中耳膽脂瘤巨噬細胞內(nèi)66個表達下調(diào)基因

表1 排名前十的表達上調(diào)基因及其GO分組和生物學功能

表達上調(diào)基因FCAR位于8個GO組，主要與中性粒細胞激活、脫顆粒、FCAR介導免疫和三級顆粒等功能有關。白細胞免疫球蛋白樣受體位于4個GO組，與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的生成有關?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）如MMP-7、MMP-9和MMP-12基因表達明顯上調(diào)，參與了降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白的生物學過程。

66個表達下調(diào)基因位于54個GO組，主要影響核糖體功能、線粒體ATP合成和呼吸鏈復合體裝配，見表2、圖4。

圖3 GO功能分析顯示所有表達上調(diào)基因分布在41個GO組

表2 排名前十的表達下調(diào)基因及其GO分組和生物學功能

2.3 信號通路分析 為了明確差異基因?qū)毎δ艿挠绊懀瑢Ρ磉_上調(diào)基因進行了KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)上述基因主要信號通路富集于與感染和炎癥有關的信號通路，包括大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染，TNF、溶酶體和趨化因子的信號通路，它們代表著炎癥信號級聯(lián)反應以及對病原體的吞噬 作用。

3 討論

在中耳炎癥時，先天免疫系統(tǒng)檢測到病原體相關的分子模式（PAMPS）和損傷相關分子模式（DAMPS），激活炎癥相關信號通路，促進血液循環(huán)中的中性粒細胞募集至中耳炎癥部位。浸潤的中性粒細胞分泌一些趨化因子招募炎癥單核細胞至炎癥部位[14]，這些單核細胞會加速轉(zhuǎn)變成巨噬細胞，其主要生物學功能是慢性感染和免疫應答[15]，可能在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，因此，篩選與巨噬細胞生物學功能相關的關鍵基因和分子通路對于闡明中耳膽脂瘤的發(fā)病機制十分重要。

圖4 GO功能分析顯示所有表達下調(diào)基因分布于54個GO組

本研究通過對中耳膽脂瘤巨噬細胞的RNA測序，篩選出124個表達上調(diào)基因， 結(jié)合GO功能分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)基因主要位于B細胞和T細胞免疫、中性粒細胞活化等組，提示中耳膽脂瘤巨噬細胞通過差異基因主要調(diào)控中耳炎癥和免疫程度。例如，肌凝蛋白是一個基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因，也被稱為活化的B細胞因子-1，能調(diào)節(jié)抗原依賴的B細胞分化[16]和促進外周Treg細胞單向發(fā)育[17]，這些免疫細胞能分泌或誘導角質(zhì)細胞產(chǎn)生多種炎癥遞質(zhì)，與炎癥細胞浸潤數(shù)量和感染嚴重程度密切相 關[18]。另外，F(xiàn)CAR屬于免疫球蛋白超家族成員，其膜外區(qū)由206個氨基酸組成，與IgA結(jié)合，使IgA免疫復合物在髓系細胞中觸發(fā)信號級聯(lián)反應，產(chǎn)生多種細胞效應，如內(nèi)吞作用、吞噬作用、抗體依賴或細胞介導的細胞毒性和刺激細胞因子釋放，尤其在黏膜表面的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。通過KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)基因參與的溶酶體、致病性大腸桿菌感染、金黃色葡萄球菌感染、TNF信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、B細胞受體等信號通路，能放大中耳的促炎反應，趨化其他免疫細胞參與反應，增強中耳炎癥過程，許多炎癥細胞因子如TNF、IL-8、IL-1α等在增強膽脂瘤細胞增殖能力和激活破骨細胞方面起重要作用[19]，這說明巨噬細胞介導的慢性細菌感染和信號級聯(lián)放大可能與中耳膽脂瘤上皮細胞異常增殖和骨質(zhì)破壞有關。

中耳膽脂瘤由囊內(nèi)容物、基質(zhì)、基質(zhì)外層三部分構成，基質(zhì)包括形成囊壁結(jié)構的角化的鱗狀上皮，巨噬細胞表達上調(diào)基因（如角蛋白-13、MMPs）直接參與調(diào)控膽脂瘤角化鱗狀上皮增殖和基質(zhì)重構。角蛋白-13是上皮細胞中間絲細胞骨架的主要成分，具有維持皮膚最外層上皮細胞完整性和正常功能的作用，直接參與細胞的分裂、分化及凋亡等過程[20]。本研究顯示角蛋白-13在中耳膽脂瘤基質(zhì)中表達上調(diào)，提示角質(zhì)形成細胞處于低分化狀態(tài)，具有較高的增殖和遷移能力，影響原上皮和組織結(jié)構的穩(wěn)態(tài)，導致角蛋白碎屑和代謝物堆積。以往對角蛋白的研究還表明，它們與TNF-α、IL-1β等信號轉(zhuǎn)導之間存在著功能聯(lián)系，參與激活破骨細胞，可能是膽脂瘤侵襲骨質(zhì)的原因之一[21]。還有研究發(fā)現(xiàn)隨著膽脂瘤分期的進展，角蛋白-13在外耳道基底上層的表達會逐漸增強，說明角蛋白-13與中耳膽脂瘤的病理過程密切相關[22]。MMPs是一種鋅鈣依賴的肽鏈內(nèi)切酶，在生理情況下表達水平極低，而在炎癥因子和氧化應激等情況下表達顯著上調(diào)。它通過降解ECM和促進ECM重構[23]，影響角質(zhì)上皮細胞的增殖、遷移和分化[24]。研究發(fā)現(xiàn)，中耳膽脂瘤的侵襲能力與MMP-13表達平均光密度顯著相關，MMP-13能降解骨基質(zhì)內(nèi)的膠原引起骨質(zhì)破壞，說明其在中耳膽脂瘤骨破壞中發(fā)揮重要作用[25]。MMP-7的作用底物更為廣泛，包括ECM底物，如IV型膠原、明膠、纖連蛋白，以及具有特殊生物學活性的各種分子，如β4-整合素、E-鈣黏蛋白、TNFα前體，MMP-7通過激活這些底物，破壞細胞完整性和相互連接，導致基質(zhì)重構和上皮遷移，本研究證實MMP-7在中耳膽脂瘤中高表達，可能與中耳膽脂瘤上皮增殖、骨質(zhì)破壞等有關。

綜上所述，本研究篩選出中耳膽脂瘤巨噬細胞的差異表達基因，這些基因富集于炎癥和免疫反應相關信號通路；角蛋白-13、MMPs是影響細胞增殖和骨質(zhì)破壞的關鍵基因，在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。