崔世恩，文楚然，張業(yè)偉，劉蜀，葉長生，姚廣裕

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普外科學(xué)乳腺科，廣東廣州 510515；2中山市人民醫(yī)院乳腺科，廣東中山 528403；3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550001；4貴陽市婦幼保健院乳腺科，貴州貴陽550003

乳腺癌是女性中第2常見的癌癥，僅次于皮膚癌［1］，其病因尚不清楚，有報道稱其余患者激素水平相關(guān)［2］，同時患者的年齡、腫瘤家族史、酗酒情況以及攜帶可能與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的突變基因也有可能在各個層面誘導(dǎo)促進了乳腺癌的發(fā)生［3-4］。各種因素獨立或共同誘導(dǎo)了某些基因的異常表達［5-6］，在機制層面誘發(fā)了乳腺癌。核小體組裝蛋白1-Like-1（NAP1L1）是核小體組裝蛋白（NAP）家族的一個成員［7］，它參與了DNA的復(fù)制［8］，有助于調(diào)節(jié)細胞生長［9］且可能在調(diào)節(jié)染色質(zhì)形成中發(fā)揮作用。既往研究中，NAP1L1被認為是一種潛在的腫瘤啟動子，它已被證實參與了包括結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等多種腫瘤的發(fā)?。?0-14］。但NAP1L1在乳腺癌中的作用和分子機制尚未見報道。本研究團隊基于臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，選擇39例乳腺癌組織標本的芯片以及額外相互配對的19例符合乳腺癌臨床病理分類的、手術(shù)前未經(jīng)其他治療的乳腺癌及癌旁組織，通過免疫組織化學(xué)染色方法進行染色評分，以期了解NAP1L1 在癌變及正常組織中的表達變化。雖然NAP1L1已在多種腫瘤中被報道為參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進腫瘤增殖，但該分子與乳腺癌之間的關(guān)系尚未見諸報道。本課題組可能為后續(xù)該分子在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的研究，提供一定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集139例乳腺癌組織標本的芯片以及額外相互配對的19例乳腺癌及癌旁組織，芯片購自上海芯超生物技術(shù)公司。標本收集時間為2001年1月～2004年8月，隨訪時間為108～150月，標本類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，其中13例除浸潤性導(dǎo)管癌外還伴有浸潤性小葉癌，1例標本包含浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌及大汗腺癌?；颊吣挲g分布在29～83歲，所有患者均未行術(shù)前放療、化療、激素治療以及免疫治療?；颊吲R床病理資料包括年齡、腫瘤大小、病理分級、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR及HER2等。納入標準：符合乳腺癌臨床病理分類（2009年AJCC 第7版）；患者年滿18歲具有完全行為能力，經(jīng)知情告知同意加入該樣本采集計劃；患者在接受手術(shù)前未經(jīng)過放、化療及內(nèi)分泌、免疫治療等其他治療方式。排除標準為：患者因為各種原因無法配合完成研究；患者合并有其他惡性腫瘤疾病或在術(shù)前已經(jīng)接受其他治療方式；病人相關(guān)病理或基本信息采集不完整影響后期評估分析。上海芯超公司歸納搜集了本次實驗中所有組織，標本搜集經(jīng)自浙江省臺州醫(yī)院，經(jīng)該院倫理委員會批準，征得患者的知情同意并提供患者臨床病理信息。

1.2 實驗試劑

NAP1L1 單克隆抗體（Abcam，Cambridge），標號mAb ab178687，抗性兔抗人，工作濃度1∶300 SP 及DAB試劑盒（中衫金橋科學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

免疫組化采用通用小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)檢測。4 ℃冷藏保存組織切片，使用前取出放入60 ℃烤箱烘片>2 h，配置純二甲苯2缸以及濃度分別為100%、95%、90%、80%、70%的酒精（配置體積需保證能完全沒過標本），烤箱取出立即組織切片放入二甲苯中脫蠟15 min，換下缸二甲苯脫蠟15 min，在濃度梯度降低的酒精缸中依次過缸2 min脫蠟，PBS洗片，入切片到預(yù)熱沸騰的檸檬酸修復(fù)液，維持臨界沸騰狀態(tài)20 min，自然冷卻至室溫取出。PBS洗片，NAP1L1 4 ℃孵育>8 h，此后依次與二抗、反應(yīng)增強液結(jié)合，最后DAB顯色，用蘇木素染核，水洗返藍，封片采圖。

1.4 染色結(jié)果判定

采取雙盲評分，組織染色分別由2名對臨床參數(shù)不知情的高年資病理醫(yī)生評分。判定標準采用半定量法在400×高倍顯微鏡下觀察，連續(xù)選擇5個高倍視野。依據(jù)DAB棕色顆粒在組織上的沉積顏色的強度評分，標準為：無著色0分、淡黃色1分；黃褐色2分、褐色3分。視野中的著色陽性細胞數(shù)<5%為；染色面積評分標準為：<10%0 分；10%～25%1 分；26%～50% 2 分；50%～75%3分；>75%4分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)顯示為至少3個獨立實驗的均數(shù)±標準差。組間比較采用雙尾學(xué)生t檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAP1L1在乳腺癌組織中表達

CPTAC數(shù)據(jù)庫提示NAP1L1蛋白在乳腺癌中上調(diào)（圖1）。配對病理組織免疫組化實驗提示NAP1L1主要表達在胞漿，且腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織（圖2 A～B）。158例乳腺組織標本中，NAP1L1低表達有89例（56.33%），高表達有69例（43.67%）；19例乳腺癌旁組織標本中NAP1L1低表達有17例（89.47%），高表達僅2例（10.53%）。NAP1L1在腫瘤組織中表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖1 CPTAC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)提示NAP1L1蛋白在乳腺癌中表達上調(diào)Fig.1 CPTAC data suggests that the expression of NAP1L1 protein is up-regulated in breast cancer

2.2 NAP1L1在乳腺癌組織中表達與癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

圖2 NAP1L1在乳腺癌及癌旁中的表達Fig.2 Expression of NAP1L1 in breast cancer as well as its adjacent tissues

表1 NAP1L1在乳腺癌及癌旁組織中的表達Tab.1 The expression of NAP1L1 in breast cancer and adjacent tissues[n(%)]

為了進一步明確NAP1L1在乳腺癌中表達上調(diào)的重要性，我們利用卡方檢驗分析NAP1L1在乳腺癌組織中表達與癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAP1L1表達雖與乳腺癌患者的年齡、臨床分期、病理分期等無明顯相關(guān)，但與乳腺癌腫瘤大?。≒=0.019）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.037）、PR表達（P=0.007）呈明顯負相關(guān)（表2）。

2.3 NAP1L1表達與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

139例資料完整的乳腺癌患者病理隨訪108～150月，其中死亡42例，高表達組死亡26例，組中位生存時間125月（平均89.2月，隨訪期間內(nèi)），明顯低于低表達組的128.5 月（平均116.5 月，隨訪期間內(nèi)）。Kaplan-Meier生存分析顯示，NAP1L1高表達患者的綜合生存時間明顯低于低表達患者（P<0.001，圖3）。

2.4 Cox比例風(fēng)險回歸模型的分析

將患者的年齡、臨床分期、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PR、ER、HER2及NAP1L1的表達水平等可能影響乳腺癌預(yù)后的因素進行單因素Cox比例風(fēng)險回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病理分級（P=0.030）、ER（P=0.031）和NAP1L1表達水平（P<0.001）與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。將這些臨床參數(shù)進行多因素分析顯示：病理分級（P=0.020）、ER（P=0.036）與NAP1L1 表達水平（P<0.001）仍是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素（表3）。

2.4 乳腺癌組織中NAP1L1與PR表達之間的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析顯示，在乳腺癌組織中，NAP1L1 與PR 的表達相關(guān)系數(shù)為γ=0.230，提示NAP1L1與PR表達存在著正相關(guān)性趨勢，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007，表4）。

3 討論

國內(nèi)腫瘤學(xué)研究團隊較早就觀察到了NAP1L1在肝癌中較癌旁組織表達升高，且升高的NAP1L11與肝硬化與AFP 水平密切相關(guān)［10］。但該研究并沒有對NAP1L1在其他常見腫瘤中的表達情況予以探索。既往研究中，NAP1L1被報道促進了腫瘤發(fā)病過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-532-5p通過KRAS-NAP1L1/P-ERK軸干擾EST1 介導(dǎo)的正反饋回路來抑制腎癌細胞增殖［11］；Chen等［12］觀察到PRDM8通過靶向NAP1L1抑制肝細胞癌發(fā)病機制的發(fā)生發(fā)展。此外，研究發(fā)現(xiàn)NAP1L1表達升高可以促進結(jié)直腸癌、肺癌和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤生物癌變［13-15］。然而，NAP1L1在乳腺癌中的作用和分子基礎(chǔ)從未被文獻記載。

表2 NAP1L1表達與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab.2 Correlation of NAP1L1 expression with clinicopathological characteristics of patients with Breast cancer[n(%)]

圖3 NAP1L1表達與患者綜合生存之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between the expression of NAP1L1 and the overall survival of patients.

為了明確NAP1L1在乳腺癌中可能的作用，我們首先基于CPTAC數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，NAP1L1蛋白在乳腺癌中上調(diào)；為了進一步驗證該結(jié)果，我們利用免疫組化檢測了NA1L1在乳腺癌組織與乳腺組織中的表達。結(jié)果顯示，NAP1L1主要表達在乳腺癌和乳腺組織胞漿中。正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中NAP1L1蛋白的表達顯著上調(diào)（P=0.006）。該結(jié)果提示類似其在大腸癌、肺腺癌和人肝癌以及小腸胰腺內(nèi)分泌腫瘤表達數(shù)據(jù)等［13-16］，這建議其在乳腺癌發(fā)病中可能發(fā)揮了重要的作用。

為進一步確定NAP1L1蛋白表達的重要性，我們分析了其表達與乳腺癌患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NAP1L1蛋白表達雖與乳腺癌患者的年齡、臨床分期、病理分期等無明顯相關(guān)，但與乳腺癌腫瘤大?。≒=0.019）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.037）。該數(shù)據(jù)表明，NAP1L1蛋白表達可能顯著促進了乳腺癌細胞的增殖，并可能與參與促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程。該結(jié)果與既往肺腺癌以及肝癌報道的結(jié)果類似，進一步表明該基因在乳腺癌發(fā)病中的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)，NAP1L1蛋白表達與PR表達（P=0.007）呈明顯正相關(guān)，這提示，在NAP1L1可能更多的參與了PR陽性乳腺癌的發(fā)病過程，后續(xù)需要相關(guān)的實驗去證實。

表3 乳腺癌單因素變量與多因素變量的COX回歸分析Tab.3 Summary of univariate and multivariate Cox regression analysis

表4 NAP1L1與PR在乳腺癌組織中表達相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between NAP1L1 and ER expression in breast cancer

在以往的研究中，NAP1L1蛋白表達升高被作為不利的預(yù)后因子促進了腫瘤的發(fā)病過程［16-17］。本研究也發(fā)現(xiàn)，NAP1L1蛋白表達與乳腺癌患者綜合生存時間明顯呈負相關(guān)。NAP1L1蛋白表達越高，患者總生存時間越短。該結(jié)果表明了NAP1L1可能在乳腺癌中發(fā)揮了候選癌基因的作用。我們利用Cox 比例風(fēng)險回歸分析NAP1L1是否是乳腺癌獨立的預(yù)后預(yù)測因子。單變量分析顯示，病理分級、ER和NAP1L1表達水平與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。在將這些臨床參數(shù)進行多因素分析顯示：病理分級、ER與NAP1L1表達水平仍是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素。該結(jié)果進一步表明NAP1L1變異表達在乳腺癌發(fā)病中的重要性。

綜上，NAP1L1蛋白表達水平在乳腺癌中明顯升高，統(tǒng)計分析提示促進了乳腺癌臨床進展和較差的預(yù)后，并作為一個獨立預(yù)后預(yù)測因子。這表明了NAP1L1升高的表達在乳腺癌發(fā)病過程中的重要性。