龍新陽(yáng),黃勝珠，白玉蘭，陳澤鳳,莫曾南

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究中心；2.廣西基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣西基因組與個(gè)性化藥物協(xié)同創(chuàng)新中心；4.廣西高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧 530021；6.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿腎臟病研究所，南寧 530021）

骨質(zhì)疏松癥是由許多因素（遺傳、代謝和環(huán)境）相互作用引起的復(fù)雜性骨疾病，目前已成為影響公共衛(wèi)生的重大負(fù)擔(dān)。老年人是受該疾病影響的主要人群，主要是因?yàn)楣堑V物質(zhì)密度在達(dá)到峰值后隨年齡下降。隨著世界人口老齡化社會(huì)的進(jìn)展[1]，骨骼健康問題需要得到密切的關(guān)注。在研究中，骨密度通常被用作是骨質(zhì)疏松癥的替代表型[2]，是指單位面積的骨量大?。╣/cm2）。然而，骨密度的改變機(jī)制和危險(xiǎn)因素仍不清楚。

脂聯(lián)素是一種來自脂肪細(xì)胞的激素，可以調(diào)節(jié)胰島素敏感性并且具有抗炎特性[3-4]。在骨骼代謝中，炎癥則會(huì)誘導(dǎo)M-CSF和RANKL的表達(dá)，刺激破骨細(xì)胞并抑制成骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨量減少。同時(shí)，脂聯(lián)素[5]及其受體也在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中表達(dá)，表明脂聯(lián)素可能在骨骼重建中發(fā)揮作用。除此之外，許多流行病學(xué)的研究也探討了血清中脂聯(lián)素和骨密度之間的關(guān)聯(lián)，但結(jié)果并不一致[6-9]。觀察流行病學(xué)研究提供了暴露與結(jié)果之間關(guān)聯(lián)的大量信息。但是，由于混雜因素和反向因果關(guān)系的影響，并不能將它們解釋成因果關(guān)系[10-11]。盡管隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)仍然是推斷因果關(guān)系的金標(biāo)準(zhǔn)，但它們極其昂貴，耗時(shí)且失敗率很高[12-13]。最近，通過引入工具變量（IV）的概念，孟德爾隨機(jī)化（MR）方法可用于評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)因素與結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)是否與因果關(guān)系一致[14]。MR 分析是使用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行的[15]，這種數(shù)據(jù)通常由各隊(duì)列進(jìn)行提供[16-17]。為了確定正常范圍內(nèi)的高脂聯(lián)素水平是否與骨骼健康有因果關(guān)系，本組通過匯總數(shù)據(jù)執(zhí)行了兩樣本雙向MR。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 對(duì)于脂聯(lián)素，在ADIPOGen隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)了162個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與血清中脂聯(lián)素水平具有相關(guān)關(guān)系（P＜5×10-8）[18-19]。這是一項(xiàng)針對(duì)歐洲血統(tǒng)（n=39 883）的meta 分析，在分析中針對(duì)年齡、性別、體重指數(shù)等因素進(jìn)行了校正。

對(duì)于骨密度，本組選擇GEFOS 隊(duì)列在2015 年提供的相關(guān)GWAS匯總數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包含一個(gè)歐洲血統(tǒng)隊(duì)列中的股骨頸骨密度（n=32 735）、腰椎骨密度（n=28 498）和前臂骨密度（n=8 143）3份數(shù)據(jù)。在該GWAS 分析中，性別、年齡和體重均已得到了校正。此外，本組的分析還包括來自UKbiobank 的足跟骨密度（n=426 824）數(shù)據(jù)[20]。受試者同樣為歐洲血統(tǒng)，校正了年齡、性別等因素。本研究不需要進(jìn)行道德批準(zhǔn)，因?yàn)樗袛?shù)據(jù)都是可公開訪問的公共數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)來源和MR分析過程，見圖1。

圖1 MR分析流程圖

1.2 IV的要求和方法 根據(jù)MR的工作原理，IV必須要滿足3個(gè)條件（圖2），因此本研究對(duì)具有顯著性的SNP 進(jìn)行了一系列的檢查和處理，選擇合適的IV。首先，計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量來避免弱IV 的存在[21]，要求F統(tǒng)計(jì)量大于10。其次，因?yàn)檫B鎖不平衡（LD）代表等位基因在不同位點(diǎn)的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)，將導(dǎo)致MR分析中的偏差，因此本研究對(duì)SNP 進(jìn)行了聚類，生成獨(dú)立的IV。第三，在GWAS Catalog和Phenoscanner 兩個(gè)網(wǎng)站檢查潛在的混雜，排除與混雜相關(guān)的SNP后，進(jìn)行第2次分析。

如果結(jié)果數(shù)據(jù)集中沒有所需的SNP，則使用LD“代理”的SNP，代理SNP與原始SNP具有高度相關(guān)性。網(wǎng)站（https://ldlink.nci.nih.gov/）提供了有效實(shí)現(xiàn)此功能的工具，選擇決定系數(shù)（R2）最大的SNP 作為代理SNP。

圖2 MR分析示意圖

1.3 MR 分析 使用3 種方法進(jìn)行MR 分析，分別為隨機(jī)效應(yīng)的逆方差加權(quán)法（IVW）、加權(quán)中位數(shù)法（WME）和MR-Egger 回歸法。計(jì)算暴露遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（GRS），并分析其與結(jié)局的關(guān)聯(lián)。

1.4 異質(zhì)性與多效性 IV之間可能存在異質(zhì)性，這也違反了上述假設(shè)[22]。使用Cochran’s Q 統(tǒng)計(jì)量去檢測(cè)異質(zhì)性（P＜0.05）。同時(shí)，用I2統(tǒng)計(jì)量[23]來量化異質(zhì)性的程度。MR Egger 截距[24]可以檢查定向多效性：當(dāng)截距接近于零時(shí)，可以認(rèn)為不存在定向多效性或定向多效性達(dá)到了平衡。

1.5 統(tǒng)計(jì)效力的計(jì)算 脂聯(lián)素的遺傳力約為3%，從https://shiny.cnsgenomics.com/mRnd/[25]上計(jì)算MR分析的統(tǒng)計(jì)效力（power）。根據(jù)之前的流行病學(xué)研究[26]，本研究的計(jì)算結(jié)果表明，在分析股骨頸、腰椎和足跟骨密度時(shí)，MR 分析有充足的功效發(fā)現(xiàn)因果關(guān)系（power 分別為0.98、0.97 和1.00）。但是，在前臂骨密度分析中，power僅為0.56。

1.6 探索潛在的反向因果關(guān)系 在反向MR 分析中，暴露來自最大樣本量的UKBiobank 數(shù)據(jù)，結(jié)局采用ADIPOGen 數(shù)據(jù)。由于沒有證據(jù)表明肥胖能夠改變骨密度對(duì)脂聯(lián)素水平的影響，因此在反向MR分析中不排除相應(yīng)的混雜因素。與正向MR分析一致，本組進(jìn)行了MR分析以及GRS分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 主要采用R 軟件（3.6.1 版本）的“TwoSampleMR”和“gtx”包進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP 的選擇 從暴露數(shù)據(jù)中提取出126 個(gè)與脂聯(lián)素水平強(qiáng)相關(guān)的SNP。通過聚類后獲得21 個(gè)獨(dú)立的SNP作為IV，其F為25～316（表1）。通過文獻(xiàn)綜述，認(rèn)為肥胖相關(guān)的SNP可能是分析的混雜因素。在排除混雜因素后進(jìn)行二次MR 分析，以比較結(jié)果的異同，從而評(píng)估混雜因素的影響。在結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)中查找IV 與結(jié)局的關(guān)系。本研究查找了4 個(gè)缺失SNPs (rs731839、rs1108842、rs187868、rs6444175)的代理，以便進(jìn)行后續(xù)分析（表2）。

表1 與脂聯(lián)素水平相關(guān)的21個(gè)SNP的特征

表2 代理SNP情況

2.2 MR 分析結(jié)果 首次分析納入21 個(gè)SNP 作為IV，IVW 分析結(jié)果表明，脂聯(lián)素和所有位置（前臂、股骨頸、腰椎、足跟）的骨密度均無因果關(guān)系（均P＞0.05）。WME 和MR-Egger 回歸法獲得了類似的結(jié)果。二次分析納入11 個(gè)獨(dú)立的SNP（rs266743、rs822354、rs187868、rs16861209、rs7649121、rs17366568、rs6444175、rs7615090、rs2980879、rs7955516、rs12051272），其IVW分析的結(jié)果依舊不支持存在關(guān)聯(lián)（均P＞0.05），見表3。

2.3 異質(zhì)性和多效性分析 首次分析時(shí)，在足跟骨密度的研究中存在高度異質(zhì)性（IVW：I2=92.4%；MR-Egger：I2=91.5%），在腰椎骨密度的研究中具有中等異質(zhì)性（IVW：I2=41.0%；MR-Egger：I2=23.1%），在前臂和股骨頸骨密度的研究中為輕度異質(zhì)性或不存在異質(zhì)性。在二次分析中，除了針對(duì)足跟骨密度分析中仍存在較大異質(zhì)性，其他部位分析的異質(zhì)性消失。類似的現(xiàn)象也體現(xiàn)在多效性分析中，見表4。

表3 MR分析結(jié)果

表4 MR分析的異質(zhì)性檢測(cè)和多效性分析

2.4 GRS 分析 GRS 分析納入21 個(gè)SNP 時(shí)，脂聯(lián)素能夠影響腰椎和足跟骨密度（P=0.046、P=0.003），見表5。但此時(shí)存在較大的異質(zhì)性。如果剔除肥胖相關(guān)的SNP，脂聯(lián)素和腰椎骨密度無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

表5 GRS分析對(duì)結(jié)局的影響

2.5 反向MR 的結(jié)果 在反向MR 分析中獲得了1 103 個(gè)強(qiáng)相關(guān)的SNP。由于候選IV 眾多，本組選擇了更嚴(yán)格的LD標(biāo)準(zhǔn)（R2=0.01）。在進(jìn)行聚類與匹配后，最終納入309 個(gè)SNP。MR 分析與GRS 分析結(jié)果，見表6。

表6 反向MR分析結(jié)果

3 討論

骨髓脂肪組織被認(rèn)為是內(nèi)分泌器官，并且在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)和骨量中起著至關(guān)重要的作用[27]。脂聯(lián)素是一種分泌自脂肪細(xì)胞的激素，可以通過多種方式影響骨骼代謝。在人體中，脂聯(lián)素及其受體（AdipoR1 和AdipoR2）都在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中表達(dá)。然而，脂聯(lián)素對(duì)骨的作用仍存在爭(zhēng)議[28]。研究發(fā)現(xiàn)，升高的脂聯(lián)素會(huì)積極影響骨骼的形成。JNK和AMPK 的兩個(gè)途徑是脂聯(lián)素刺激骨骼生長(zhǎng)并通過中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)調(diào)節(jié)骨量的主要途徑[28]。此外，為了影響成骨細(xì)胞的增殖和分化以增加骨量，脂聯(lián)素還影響破骨細(xì)胞的機(jī)制[29-31]。然而，一些研究也表明脂聯(lián)素可能對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)[28]。在小鼠相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，由于這些不同的機(jī)制，使得脂聯(lián)素相關(guān)的基因過表達(dá)和基因敲除小鼠的骨含量結(jié)果存在爭(zhēng)議[29,32]。除此之外，在流行病學(xué)研究中脂聯(lián)素水平與骨密度成強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系[6,33-36]，雖然這種關(guān)聯(lián)具有性別的差異。在一個(gè)出生隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)：脂聯(lián)素是男性3個(gè)不同部位骨密度及女性腰椎骨密度的生物標(biāo)記物[6]。而在InCHIANTI 隊(duì)列中，只在女性中發(fā)現(xiàn)了這種關(guān)聯(lián)性[33]。更有臨床研究直接指出：脂聯(lián)素是骨折的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[37]?？偠灾?，目前的研究說明脂聯(lián)素在骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

本研究中，MR 模型研究脂聯(lián)素與多部位骨密度之間的關(guān)系，結(jié)果表明，無論是否排除與肥胖相關(guān)的SNP，脂聯(lián)素水平總體上都不會(huì)影響骨密度的大小。本研究還發(fā)現(xiàn)，影響肥胖的SNP會(huì)顯著增加分析時(shí)的異質(zhì)性。這種現(xiàn)象主要發(fā)生在腰椎骨密度上，這可能是由于不同骨骼部位的遺傳機(jī)制不完全一致所導(dǎo)致的[38]。除此之外，也不太可能存在反向因果關(guān)系，這也有助于理解這兩者之間的關(guān)系。

使用MR模型探索因果關(guān)系有著十分明顯的優(yōu)勢(shì)。第一，MR分析基于分離定律，可以有效消除潛在的混雜因素和反向因果關(guān)系的干擾。第二，與小樣本的流行病學(xué)研究相比，GWAS 匯總數(shù)據(jù)包含的樣本更大，能獲得更高的檢驗(yàn)功效。第三，本研究中的所有數(shù)據(jù)均來自歐洲人口，避免了種族偏倚的影響。第四，本研究中的所有GWAS數(shù)據(jù)均來自不同的隊(duì)列，這很大程度上避免了由樣本重疊引起的估計(jì)偏倚。但是，本研究也有一些局限性。首先，MR 模型為線性關(guān)系，無法探討非線性關(guān)系；其次，骨密度與性別和年齡密切相關(guān)，但本研究未能對(duì)性別或年齡進(jìn)行分層分析；最后，仍然無法排除未知的混雜因素帶來的影響。

綜上，遺傳上血清中高水平的脂聯(lián)素與骨密度降低或骨折風(fēng)險(xiǎn)增加無關(guān)，流行病學(xué)上觀察到的關(guān)聯(lián)可能是由混雜因素引起的。