霍健君，李梅華，馬 南，邱居烽，冷子楊，王紹霜，鐘小寧，何志義

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021)

煙草煙霧誘發(fā)肺部的炎癥被認(rèn)為是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且其數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系[1]。巨噬細(xì)胞通過(guò)驅(qū)動(dòng)炎癥的起始和消退在炎癥反應(yīng)和先天免疫中發(fā)揮重要作用。當(dāng)受到煙草煙霧刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞可分泌相關(guān)炎癥介質(zhì)[2]，如白細(xì)胞介素（IL）-8，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答—涉及組蛋白去乙酰化酶（HDACs）和核因子（NF）-кB 的調(diào)控[3]。HDACs 被證實(shí)主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與先天免疫[4]，其去乙?；饔每杉訌?qiáng)DNA 與組蛋白的結(jié)合，并阻礙轉(zhuǎn)錄因子的活性[5]。有研究報(bào)道，I 型組蛋白去乙酰化酶（HDAC3）可通過(guò)阻礙NF-κB 核易位，抑制炎性基因的轉(zhuǎn)錄[6]。近年來(lái)研究證實(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物對(duì)于中至重度穩(wěn)定期和急性加重期的COPD 患者具有良好的治療效果[7-8]，是作為今后治療COPD 新藥的重要選擇之一[9]。有研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物紅霉素（EM）具有獨(dú)特的抗炎活性，可以抑制煙草煙霧暴露所致的炎癥[10-11]。而目前關(guān)于EM抑制煙草煙霧提取物（CSE）誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞炎癥的具體機(jī)制仍未明確。本研究旨在通過(guò)探討EM 抑制CSE 誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞炎癥的作用，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)EM抗炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人單核細(xì)胞株U937細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。佛波脂（PMA）、EM、NF-κB特異性抑制吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）及HDACs 特異性抑制劑曲古霉素（TSA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。真龍牌過(guò)濾嘴香煙（焦油：15 mg，煙堿1.1 mg）購(gòu)自廣西南寧卷煙廠。CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物公司；IL-8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；DIG凝膠遷移率試劑盒購(gòu)自瑞士Roche 公司；核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；HDAC3、NF-κB抗體分別購(gòu)自美國(guó)Santa Crus、Cell Signaling Technology 公司。E-Gel Imager 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)出自美國(guó)Licor公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分化 將U937細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃干凈細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周進(jìn)行2次傳代。將細(xì)胞以1×107個(gè)/孔的密度均勻接種于6孔板中，加入10 ng/mL PMA 誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞[12]，24 h后棄上清，更換新培養(yǎng)基。

1.3 CSE 的制備[13-14]將2 支點(diǎn)燃的去過(guò)濾嘴香煙連接于氣體收集裝置，用50 mL注射器連續(xù)抽吸，使煙草煙霧通入20 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)pH 值至7.4，0.22 μm 無(wú)菌濾器過(guò)濾，制成10% CSE 無(wú)菌溶液，稀釋至工作濃度，在1 h內(nèi)使用。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將U937 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后，分別加入不同濃度CSE（0.5%、1%、2%）和EM（1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL）干 預(yù)24 h、48 h、72 h，各設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，棄上清，按照CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D450值代表巨噬細(xì)胞活力，篩選最佳作用濃度及時(shí)間。

1.5 細(xì)胞上清液IL-8 檢測(cè) 收集對(duì)照組、CSE 組（1% CSE 刺激24 h 或48 h）、CSE+EM 組（EM 預(yù)孵育24 h 或48 h 后加1% CSE 刺激24 h）和CSE+PDTC 組（PDTC 預(yù)孵育24 h 或48 h 后加1%CSE 刺激24 h）細(xì)胞上清，1 000 r/min離心5 min，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)IL-8的濃度。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-кB 活性的檢測(cè) 收集對(duì)照組、CSE 組（1%CSE 刺激24 h）、CSE+EM 組（EM 預(yù)孵育24 h 或48 h 后加1% CSE 刺激24 h）和CSE+PDTC組（PDTC預(yù)孵育24 h后加1%CSE刺激24 h）細(xì)胞，按核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核蛋白提取，BCA 法檢測(cè)濃度，Invitrogen 公司合成NF-кB 探針并以地高辛（DIG）標(biāo)記，按照凝膠遷移率阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行探針蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)NF-кB探針蛋白結(jié)合情況，以此代表其活性。

1.7 Western blotting法檢測(cè)HDAC3和NF-кB蛋白表達(dá) 收集對(duì)照組、CSE 組（1% CSE 刺激24 h）、CSE+EM組(EM預(yù)孵育24 h后加1%CSE刺激24 h）和TSA 組（TSA 孵育24 h）細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌，加RIPA 蛋白裂解液，離心，取上清測(cè)蛋白濃度，SDSPAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST 洗膜，分別加入一抗HDAC3、NF-кB、β-Actin（均為1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加熒光二抗（1∶10 000）室溫下?lián)u床避光孵育1 h，TBST 洗膜。Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白條帶灰度值，Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CSE 及EM 對(duì)人巨噬細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，2%CSE作用24 h、48 h、72 h后細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），100 μg/mL EM 作用48 h、72 h 后細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），其他濃度的CSE 及EM 在24 h、48 h、72 h 均未對(duì)巨噬細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，見(jiàn)圖1。為使CSE 及EM 盡可能發(fā)揮各自作用并參考以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]，本實(shí)驗(yàn)選取終濃度為1% CSE 及1 μg/mL EM 作用24 h 或48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度CSE及EM對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

2.2 各組細(xì)胞上清中IL-8 濃度比較 與對(duì)照組比較，1%CSE 刺激24 h 或48 h 后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-8 濃度均顯著增高（P＜0.05），而EM 和PDTC預(yù)孵育24或48 h均能明顯抑制用1%CSE刺激24 h對(duì)巨噬細(xì)胞IL-8表達(dá)的上調(diào)作用（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性比較 與對(duì)照組比較，CSE組轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與CSE組比較，EM（預(yù)孵育24 h或48 h）以及PDTC可明顯抑制CSE對(duì)人巨噬細(xì)胞NF-кB的激活作用（P＜0.05），其中EM預(yù)孵育48 h較24 h的抑制作用更明顯，見(jiàn)圖3。

2.4 各組細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，CSE 組和TSA 組HDAC3 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與CSE 組比較，CSE+EM 組HDAC3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.5 各組細(xì)胞NF-кB 蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，CSE組和TSA組NF-кB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)；與CSE 組相比，CSE+EM 組NF-кB蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

圖2 各組細(xì)胞上清中IL-8含量比較

圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性比較

圖4 各組細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)水平比較

圖5 各組細(xì)胞NF-кB蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

炎癥反應(yīng)促進(jìn)COPD 的發(fā)生發(fā)展，而吸煙是COPD 的主要致病因素[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物可以通過(guò)調(diào)控激活蛋白（AP）-1、NF-кB、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等信號(hào)，減少各類(lèi)促炎因子、趨化因子及粘附分子的產(chǎn)生，抑制氣道中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，從而發(fā)揮抗炎作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，EM與NF-кB特異性抑制劑PDTC均能夠明顯抑制CSE 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-8的釋放，減輕炎癥，提示EM對(duì)CSE誘導(dǎo)的炎癥的抑制作用與PDTC類(lèi)似，猜測(cè)EM有可能通過(guò)抑制NFкB途徑產(chǎn)生作用。

NF-кB對(duì)應(yīng)于由其中兩個(gè)亞基RelA/p65和p50組成的異源二聚體，激活后易位到細(xì)胞核，與DNA結(jié)合并促進(jìn)炎性基因的轉(zhuǎn)錄[6]。Wu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 的釋放依賴(lài)于NF-кB 的激活。本研究結(jié)果顯示，EM能夠明顯抑制CSE刺激誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NFкB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，并且將EM預(yù)孵育時(shí)間從24 h延長(zhǎng)至48 h 時(shí)，可觀察到抑制作用更明顯，猜測(cè)其作用可能存在時(shí)間依賴(lài)性。此外結(jié)合前面所述NF-кB特異性抑制劑PDTC 能夠抑制IL-8，提示了NF-кB參與了IL-8 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)一步證實(shí)EM 抑制IL-8的釋放能夠通過(guò)抑制NF-кB活性實(shí)現(xiàn)的，從而發(fā)揮抑制與CSE相關(guān)的炎癥的作用。

HDAC3 屬于I 型HDACs，參與調(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞增殖和炎癥基因表達(dá)[3,19]，發(fā)揮去乙?；饔茫偈筃F-кB亞基RelA/p65與IκBα結(jié)合形成出核復(fù)合體，阻礙了NF-кB對(duì)炎性基因轉(zhuǎn)錄的激活[6]；換而言之，HDAC3 去乙酰化RelA/p65 的作用控制著NF-кB 的激活和核易位。本研究結(jié)果顯示，CSE 能夠降低巨噬細(xì)胞HDAC3 的表達(dá)，同時(shí)升高NF-кB的表達(dá)，與HDACs特異性抑制劑TSA比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HDAC3 途徑參與調(diào)控NFкB，說(shuō)明了CSE 可以通過(guò)抑制HDAC3，從而激活NF-кB。此外本研究結(jié)果顯示，EM 能夠上調(diào)HDAC3 的表達(dá)，表明EM 抑制NF-кB 的活性，與活化HDAC3有關(guān)，揭示了EM抑制CSE誘導(dǎo)炎癥的可能途徑。近期在小鼠骨骼肌C2C12 細(xì)胞中，與HDAC3 同屬于I 型HDACs 的HDAC2 被證實(shí)介導(dǎo)CSE誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放[20]。但EM是否確切通過(guò)HDAC3介導(dǎo)CSE誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放還需更深入的探究。

綜上，EM 能夠抑制CSE 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-8的釋放，其抗炎作用與抑制NF-кB活性和表達(dá)及上調(diào)HDAC3表達(dá)有關(guān)。