鄭桂賢，李 超，鄧招惠，謝 婷，霍增榆，韋鑫燕，白 晶

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的以持續(xù)氣流受限為特征的慢性肺部疾病。肌少癥（sarcopenia）是COPD 常見的合并癥，表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量和力量的下降，伴隨著軀體殘疾、生活質(zhì)量下降和死亡的風(fēng)險。COPD 合并肌少癥患者疾病預(yù)后差，病死率高[1]。骨骼肌質(zhì)量的維持與骨骼肌細胞代謝、骨骼肌干細胞（衛(wèi)星細胞）肌再生能力有關(guān)[2-3]。COPD合并肌少癥的研究，集中在骨骼肌細胞代謝與骨骼肌萎縮、衰老方向[3]，對骨骼肌衛(wèi)星細胞的研究甚少。研究顯示，衛(wèi)星細胞數(shù)量、活性等下降是導(dǎo)致骨骼肌丟失的重要原因[4]。煙草煙霧調(diào)控小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞再生能力的相關(guān)機制尚未見研究報道。小鼠C2C12 成肌細胞是來源于骨骼肌前體細胞的肌源細胞，使用2%馬血清培養(yǎng)6 d可將細胞誘導(dǎo)分化為成熟的骨骼肌細胞[5]，被廣泛用于肌肉再生的體外模型研究。本實驗以小鼠C2C12 成肌細胞為研究對象，誘導(dǎo)細胞分化6 d構(gòu)建骨骼肌再生模型，研究香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）對C2C12 成肌細胞肌再生能力的影響，同時觀察分化過程中CSE對C2C12成肌細胞分化能力、衰老的影響，探討CSE 抑制小鼠骨骼肌細胞再生的機制，為COPD合并肌少癥的發(fā)病機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 小鼠C2C12 成肌細胞購于中科院上海細胞庫。胎牛血清、馬血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青－鏈霉素雙抗（Gibico 公司）；香煙（Marlboro 公司）；熒光定量擴增試劑盒（TAKARA 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 公司）；MyHC、MyoD、Myogenin 鼠單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；P53、P21、P16 兔單克隆抗體（Abcam）；β-actin兔單克隆抗體（武漢三鷹公司）；山羊抗兔熒光二抗（CST）。

1.2 CSE 的制備[5]連接驅(qū)動裝置上的注射器，去掉濾嘴，將兩支香煙固定于注射器的一端，慢慢抽吸注射器數(shù)次后，震蕩以使煙霧均勻溶于2 mL PBS中，制成CSE 懸液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌，將CSE溶液稀釋至所需濃度用于后續(xù)實驗。

1.3 C2C12 成肌細胞培養(yǎng)及實驗分組[5]在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖期的C2C12 成肌細胞，消化，離心，計數(shù)，接種相同細胞數(shù)的C2C12成肌細胞于培養(yǎng)皿中，待其鋪滿80%左右，更換成含2%馬血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞分化。從分化開始的第1天加入CSE 進行干預(yù)，每隔2 d 換液一次，分化6 d 后即可形成骨骼肌細胞。收集分化3 d 和分化6 d 的細胞用于后續(xù)實驗。將未加入CSE 干預(yù)的細胞設(shè)為正常（N）組，加入CSE干預(yù)的細胞為CSE組。

1.4 細胞免疫熒光法鑒定骨骼肌細胞 將C2C12成肌細胞接種于24 孔板中，用2%馬血清誘導(dǎo)分化培養(yǎng)6d 后，用PBS 浸洗孔板細胞3 次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗3 次，3 min/次；0.5%Triton X-100(PBS 配制)室溫通透20 min；PBS浸洗3次，3 min/次；滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，不洗，MyHC 一抗（1∶200）置于4 ℃冰箱孵育過夜。第2 天，PBS 浸洗孔板3 次，3 min/次，滴加熒光二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，PBS 浸洗3 次，3 min/次；滴加DAPI 避光孵育5 min，對孔底細胞進行染核，PBS洗4次，5 min/次，洗去多余的DAPI；然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。MyHC表達陽性（胞質(zhì)被染成紅色）表明該細胞是骨骼肌細胞，即C2C12成肌細胞成功分化為骨骼肌細胞。

1.5 Western blotting 法檢測MyHC、MyoD、Myogenin、P53、P21、P16 蛋白表達 收集培養(yǎng)皿的細胞，4 ℃離心，去掉上清后加入蛋白裂解液，30 min后再次離心吸取上清，BCA 法檢測蛋白濃度；SDSPAGE分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜，一抗孵育過夜（P53、P21、P16抗體的稀釋比為1∶1 000，MyHC、MyoD、Myogenin 抗體的稀釋比為1∶500）；洗膜，熒光二抗(1∶10 000)常溫孵育1 h，使用Odyssey紅外掃膜儀（LICOR公司）直接掃膜成像，顯示蛋白條帶。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 相對表達量 收集兩組細胞，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量擴增試劑為上機（ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀）擴增做準備。MyHC4上游引物（上海生工生物工程有限公司合成）：5’-CAGACAGAGAGGAGCAGGAGAGTG-3’，下游引物：5’-TTGGTGTTGATGAGGCTGGTGTTC-3’；MyHC7 上游引物：5’-CAGAACACCAGCCTCATCAACCAG-3’，下游引物：5’-TTCTCCTCTGCGTTCCTACACTCC-3’。首先激活酶活性（95 ℃，10 min），然后按照變性（95 ℃，15 s）、退火和延伸（60 ℃，60 s）程序，共40 個循環(huán)。用2-△△Ct法計算MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌再生模型的鑒定 顯微鏡下可見處于增殖期的C2C12 成肌細胞呈單核、梭形（圖1A），誘導(dǎo)分化6 d 后，細胞融合形成含多個細胞核的肌管（圖1B），且經(jīng)骨骼肌細胞標志物MyHC 抗體孵育后，細胞質(zhì)被染成紅色（圖1C），表示C2C12 成肌細胞成功分化為骨骼肌細胞。

2.2 兩組MyHC mRNA 及蛋白表達比較 誘導(dǎo)分化6 d 后，與N 組比較，CSE 組MyHC 蛋白水平降低，MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 表達水平顯著下降（均P＜0.05），見圖2。

圖1 不同時期的C2C12成肌細胞形態(tài)及MyHC免疫熒光圖

圖2 兩組骨骼肌細胞MyHC蛋白表達及MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA表達比較

2.2 兩組細胞分化指標MyoD、Myogenin蛋白表達比較 誘導(dǎo)分化3 d 后，與N 組比較，CSE 組細胞中MyoD、Myogenin 蛋白表達水平明顯降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組MyoD、Myogenin蛋白表達比較

2.3 兩組細胞衰老指標P53、P21、P16表達比較 誘導(dǎo)分化3d后，與N組比較，CSE 組細胞中P53、P21、P16蛋白表達水平顯著升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 兩組P53、P21、P16蛋白表達比較

3 討論

機體內(nèi)靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞具有骨骼肌再生能力，在應(yīng)對外界因素（衰老、炎癥等）中為骨骼肌提供肌核和肌纖維，對損傷修復(fù)和維持肌肉完整性有著決定性的作用[6-7]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧暴露的小鼠和COPD合并肌少癥患者骨骼肌組織中靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞減少[8]，衛(wèi)星細胞早衰及再生潛能耗盡可能是骨骼肌功能受損的原因[9]。本研究目的是通過體外復(fù)制CSE誘導(dǎo)下骨骼肌再生模型，探討CSE 對C2C12 成肌細胞分化成骨骼肌細胞中再生機制影響。

C2C12 成肌細胞具有自我增殖、定向分化為骨骼肌細胞能力，是體外研究肌肉再生的最佳模型。成肌細胞分化能力是骨骼肌細胞形成的關(guān)鍵，由肌源性調(diào)節(jié)因子（MRFs）的MyoD 家族調(diào)控分化步驟[10]。Myogenin 是MRFs 的一員，作用于MyoD 的下游，在推動成肌細胞分化的終末階段發(fā)揮這重要的作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示，C2C12成肌細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后變成肌管，分化后細胞的細胞質(zhì)被染成紅色，含多核，表明這些細胞是成熟的骨骼肌細胞，提示本研究使用的體外骨骼肌細胞再生模型是成功的。CSE 暴露下，細胞MyHC 熒光強度明顯減弱；MyHC蛋白表達水平，I型骨骼肌纖維MyHC7、II型骨骼肌纖維MyHC4的mRNA水平顯著下降（均P＜0.05）。這些結(jié)果提示，CSE抑制C2C12成肌細胞再生能力，同時表現(xiàn)為I型骨骼肌纖維MyHC7、II型骨骼肌纖維MyHC4 表達減少，提示骨骼肌細胞的耐力、肌力明顯減弱。同時，進一步的研究結(jié)果顯示，CSE干預(yù)下，成肌細胞分化指標MyoD、Myogenin表達水平明顯降低（均P＜0.05），這提示CSE 抑制C2C12成肌細胞的分化能力。Sancho-Munoz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者骨骼肌衛(wèi)星細胞數(shù)量減少，股外側(cè)肌MyoD、Myogenin 表達降低。在合并肌少癥的COPD患者的股外側(cè)肌檢測到靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞減少，激活的衛(wèi)星細胞增多；嚴重的COPD患者無論是否并發(fā)肌少癥，激活的衛(wèi)星細胞增多，觸發(fā)肌細胞再生過程。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，可推測在COPD 患者中盡管觀察到激活的衛(wèi)星細胞增多，然而激活的衛(wèi)星細胞可能并未能分化成骨骼肌細胞，從而導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量并未得到維持而是丟失。煙草煙霧調(diào)控骨骼肌再生能力值得進一步深入研究，為COPD合并肌少癥的治療及預(yù)防提供新的策略和參考。

研究認為，衰老與衛(wèi)星細胞再生能力密切相關(guān)[12-13]。P53 與骨骼肌衰老、衛(wèi)星細胞功能有關(guān)[14]。有研究證明，P53直接調(diào)控MyoD依賴性轉(zhuǎn)錄途徑，抑制Myogenin表達，調(diào)節(jié)成肌細胞分化[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，P53 在調(diào)節(jié)衛(wèi)星細胞分化和自我更新的平衡中發(fā)揮重要作用，這項研究指出P53 必須在成肌細胞退出細胞周期時快速返回到基礎(chǔ)水平，以便細胞發(fā)生分化；在未分化的成肌細胞中，p53水平持續(xù)增加抑制肌分化和促進細胞自我更新[15]。MyoD的激活誘導(dǎo)P21表達促進成肌細胞進入終末分化階段。相反，P21 誘導(dǎo)和MyoD 激活失偶聯(lián)抑制終末分化[16]。此外，靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞可由于P16 表達升高誘導(dǎo)細胞衰老，無法被激活而失去肌再生潛力[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在肢體廢用誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮模型中P53、P21 蛋白表達水平升高[17]，煙草煙霧暴露激活小鼠膈肌P53/P21 途徑，可能與膈肌萎縮相關(guān)[18]。由此可知，煙草煙霧抑制骨骼肌再生障礙的機制可能與細胞衰老有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSE暴露下，衰老因子P53、P21、P16 蛋白水平顯著增高（均P＜0.05），提示CSE 誘導(dǎo)細胞分化能力下降的同時伴有細胞衰老水平增加。CSE誘導(dǎo)P53蛋白水平升高，這與MyoD、Myogenin 蛋白水平降低的結(jié)果一致。同時，CSE也誘導(dǎo)P21蛋白水平升高，促進細胞退出細胞周期，但MyoD 蛋白表達下降，提示CSE 誘導(dǎo)C2C12 成肌細胞退出細胞周期但并未能成功進入分化時期。從這個角度理解可以解釋COPD 合并肌少癥患者骨骼肌激活衛(wèi)星細胞增多，但骨骼肌再生能力減弱這一現(xiàn)象。此外，P16 蛋白水平增高可能是CSE 誘導(dǎo)C2C12 成肌細胞衰老失去定向分化能力的機制，這也從另一個角度說明，CSE誘導(dǎo)P53水平增加可促進細胞自我更新而肌再生能力降低這一看似矛盾的結(jié)果，可能是由于這些新生的成肌細胞失去分化能力。

綜上所述，香煙煙霧暴露下C2C12成肌細胞再生能力受到抑制，可能與CSE誘導(dǎo)細胞分化能力減弱、P53/P21信號途徑激活誘導(dǎo)細胞衰老有關(guān)。