馬 可，梁銳明△，蘇 偉

（1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧 530021）

靜電紡絲技術(shù)在國(guó)內(nèi)一般簡(jiǎn)稱為電紡，是一種利用聚合物流體在強(qiáng)電場(chǎng)作用下，通過(guò)金屬噴嘴進(jìn)行噴射拉伸而獲得直徑為幾十納米或幾微米納米級(jí)纖維的紡絲技術(shù)[1]。靜電紡絲技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本小、產(chǎn)量高、工藝可控等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[2-3]。靜電紡絲制備出來(lái)的納米纖維膜具有較高的孔隙率、比表面積，形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞外基質(zhì)的特點(diǎn)[4]，可以作為組織工程支架、引導(dǎo)骨再生膜、皮膚修復(fù)敷料等應(yīng)用于骨組織、心肌、神經(jīng)、肌腱再生、神經(jīng)、心肌、及傷口愈合，在生物醫(yī)學(xué)工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，納米纖維膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)、直徑大小以及機(jī)械性能影響細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化等，因此，制備成具有不同形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的納米纖維對(duì)組織再生和修復(fù)發(fā)揮重要作用。

在納米纖維膜制備過(guò)程中，靜電紡絲對(duì)溶液的濃度有一定的要求，濃度過(guò)大導(dǎo)致粘度過(guò)高，從而導(dǎo)致難以電紡；溶液濃度過(guò)小，聚合物分子鏈之間纏結(jié)不充分，則會(huì)導(dǎo)致電紡絲表面出現(xiàn)許多串珠，影響纖維直徑[5]。接收速度同樣也影響著纖維的形貌和直徑，接收速度的增加，纖維被拉伸，直徑變細(xì)。同時(shí)，纖維的結(jié)構(gòu)和平均直徑又影響著其機(jī)械性能[1]。因此，選擇合適的濃度和接收速度是制備出直徑分布均勻和排布、較高孔隙率、優(yōu)良機(jī)械性能的納米纖維膜的關(guān)鍵。此外，電紡納米纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)和直徑大小又影響著細(xì)胞在其表面的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖能力[6-7]。

本研究選用了良好的生物相容性、良好的生物降解性和FDA批準(zhǔn)的聚己內(nèi)酯（PCL），良好的生物相容性和親水性的聚乙烯醇（PVA）以及天然的、可降解的脂肪族熱塑性聚酯聚乳酸（PLA），利用靜電紡絲技術(shù)制備不同濃度和接收速度的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜。通過(guò)纖維膜的形貌觀察并計(jì)算平均直徑、機(jī)械性能檢測(cè)，探討不同濃度和接收速度對(duì)納米纖維膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的影響。同時(shí)，將大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于電紡納米纖維膜表面，通過(guò)CCK-8檢測(cè)和活死細(xì)胞染色來(lái)探究納米纖維膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和直徑大小對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響，為電紡纖維膜在生物醫(yī)學(xué)工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料 PCL:純度≥97%，Sigma-Aldrich，中國(guó)；PLA:分析純，麥克林，中國(guó)；PVA:醇解度87%～89%，麥克林，中國(guó)；六氟異丙醇：純度≥99.5%，麥克林，中國(guó)。α-Dulbecco’s Modified Eagle Medium(α-DMEM),Gibco，美國(guó)；胎牛血清，Gibco，美國(guó)；青鏈霉素混合液，索萊寶，中國(guó)；胰蛋白酶，索萊寶，中國(guó)；PBS 緩沖液，索萊寶，中國(guó)；CCK-8，Dojindo，日本；SD 乳鼠，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國(guó)。Calcein-AM/PI染色試劑盒，Invitrogen，美國(guó)。

1.2 儀器 靜電紡絲機(jī)：HD1311，蘇州能環(huán)新材料科技有限公司，中國(guó)；磁力攪拌器：MSH-20，KEWLAB，澳洲；真空干燥箱：LW-ZDW-4，南京龍伍機(jī)械有限公司，中國(guó)；電子精密天平：XPE105，METTLER，TOLEDO，瑞士；掃描電子顯微鏡：TESCAN，VEGA3LMU，捷克；超聲波清洗機(jī)：SB25-12，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó)；力學(xué)測(cè)試儀：Instron 5943，NSTRON，美國(guó)。細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱：BB5，Thermo Fisher，美國(guó)；超凈工作臺(tái)：HCB，海爾，中國(guó)；倒置相差顯微鏡：BX53F，OLYMPUS，日本；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Multiskan GO，Thermo Fisher，美國(guó)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 分別稱取適量PCL、PLA、PVA 溶于5 mL 的六氟異丙醇溶液中，配制成不同濃度的PCL（4%、6%和8%）、PLA（8%、10%和12%）、PVA（0.4%、0.8%和1.2%）混合溶液，置于磁力攪拌器上攪拌6 h，并超聲30 min 使其充分混勻，制備成靜電紡絲溶液。將制備的電紡溶液置于靜電紡絲機(jī)的注射器上進(jìn)行電紡。在濃度對(duì)纖維膜纖維影響的研究中，選取不同的PCL、PLA和PVA原料濃度，設(shè)置紡絲的接收速度為20 r/min；在接收速度對(duì)纖維膜纖維影響的研究中，分別選取6% PCL、10%PLA、0.8%PVA 電紡溶液，設(shè)置紡絲的接收速度分別為20 r/min、80 r/min和140 r/min進(jìn)行電紡。其他條件設(shè)置為電壓為15 kV，噴射速度0.8 mL/h，噴嘴與收集器距離15 cm。環(huán)境條件為溫度25 ℃，濕度為35%～55%。將上述制備好的纖維膜置于真空干燥箱中干燥24 h后使用。

1.4 納米纖維膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、纖維直徑和力學(xué)性能檢測(cè) 利用掃描電鏡（SEM）觀察不同條件制備的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并隨機(jī)選取50根纖維，利用Image軟件測(cè)量它們的直徑分布并計(jì)算平均直徑。

利用力學(xué)儀器對(duì)不同條件制備的PCL、PLA 和PVA 納米纖維膜進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)來(lái)探究它們的機(jī)械性能（拉伸應(yīng)力、拉伸應(yīng)變和楊氏模量）。將每一種電紡納米纖維膜裁剪成大小為20 mm×10 m 的矩形，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量纖維膜的厚度，上機(jī)測(cè)量，設(shè)置初始距離為1 cm，拉伸速率為6 mm/min，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 向3 d大小的SD乳鼠體內(nèi)注射3%的戊巴比妥鈉溶液，隨后將乳鼠置于75%的酒精中滅菌處理。在無(wú)菌條件下，利用高壓好的剪刀和鑷子將乳鼠的四肢剪下，置于含有5%的雙抗和PBS緩沖液中，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中進(jìn)行下一步操作。將四肢取出并用PBS 清洗后，置于培養(yǎng)基中，利用無(wú)菌紗布將肌肉組織剔除干凈，再將軟骨剪下，利用注射器將骨髓沖出到培養(yǎng)皿中。最后，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換一次液，取三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞接種及活力檢測(cè) 將電紡納米纖維膜置于24 孔板中，并用銅環(huán)壓住，加入75%酒精浸泡6 h，隨后，將酒精吸去，在紫外燈下滅菌12 h。將細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min，再加入2 mL培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r離心5 min，棄去上清，再加入5 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接著進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后以3×104細(xì)胞/孔的密度接種于納米纖維膜上，培養(yǎng)3 d。

3 d后取出孔板，將培養(yǎng)液吸去，PBS清洗3遍，在避光的條件下，每孔中加入25 μL CCK-8 和250 μL 培養(yǎng)液，孵育2 h，隨后，將24 孔板中的混合液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度值。3 d 后取出孔板，將培養(yǎng)液吸去，PBS清洗3遍，在避光的條件下，加入活死細(xì)胞染色液孵育5 min，吸去染色液，隨后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶液濃度對(duì)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)和直徑的影響 不同濃度（4%、6%和8%）的PCL納米纖維的掃描電鏡圖（圖1）。當(dāng)溶液濃度為4%時(shí)，纖維表面出現(xiàn)較多的串珠，隨著濃度的增加，串珠隨之減少。

8%和10%的PLA以及0.4%的PVA的纖維表面出現(xiàn)了串珠，并且隨著濃度的增加串珠減少，纖維變得均勻（圖2、圖3）。

PCL、PLA 和PVA 3 種纖維的平均直徑均小于1 μm，并且隨著紡絲液濃度的增大，平均直徑也隨之增大，見(jiàn)表1、表2和表3。

圖1 不同濃度的PCL電紡纖維的SEM

圖2 不同濃度的PLA電紡纖維的SEM

圖3 不同濃度的PVA電紡纖維的SEM

表1 不同濃度的PCL電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表1 不同濃度的PCL電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表2 不同濃度的PLA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表2 不同濃度的PLA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表3 不同濃度的PVA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表3 不同濃度的PVA電紡纖維的平均直徑和直徑分布

2.2 接收速度對(duì)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)和直徑的影響 濃度分別為6%、10%、0.8%的PCL、PLA和PVA 3種纖維膜在80 r/min和140 r/min的接收速度下的電鏡圖像，見(jiàn)圖4、圖5 和圖6。與圖1b、圖2b、圖3b 相比，隨著轉(zhuǎn)速的加大，纖維的排列逐漸規(guī)整，但是由于靜電紡絲機(jī)的最大轉(zhuǎn)速只能達(dá)到140 r/min，所以沒(méi)有得到排列方向高度一致的纖維。

圖4 不同接收速度所得的PCL電紡纖維的SEM

圖5 不同接收速度所得的PLA電紡纖維的SEM

圖6 不同接收速度所得的PVA電紡纖維的SEM

表4、表5和表6顯示，隨著轉(zhuǎn)速的加大，纖維直徑逐漸變小。

表4 不同接收速度所得的PCL 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表5 不同接收速度所得的PLA 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

表6 不同接收速度所得的PVA 電紡纖維的平均直徑和直徑分布

2.3 溶液濃度對(duì)纖維膜機(jī)械性能的影響 對(duì)不同濃度的PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜的力學(xué)性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，隨著濃度的增加，3 種纖維膜的力學(xué)性能先增加后降低，見(jiàn)表7、表8、表9。

表7 不同濃度的PCL電紡纖維膜的力學(xué)性能

表7 不同濃度的PCL電紡纖維膜的力學(xué)性能

與4%組比較，*P＜0.05。

表8 不同濃度的PLA電紡纖維膜的力學(xué)性能

表8 不同濃度的PLA電紡纖維膜的力學(xué)性能

與8%組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表9 不同濃度的PVA電紡纖維膜的力學(xué)性能

表9 不同濃度的PVA電紡纖維膜的力學(xué)性能

與0.4%組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 接收速度對(duì)纖維膜機(jī)械性能的影響 從不同濃度的纖維膜中選出力學(xué)性能較好的濃度，分別為6%、10%、0.8%的電紡PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜，將接收速度分別設(shè)置為20 r/min、80 r/min 和140 r/min。對(duì)通過(guò)不同接收速度所得到的纖維膜進(jìn)行力學(xué)測(cè)試，結(jié)果表明，隨著接收速度的增加，3 種纖維膜的力學(xué)性能逐漸降低，見(jiàn)表10、表11和表12。

2.5 溶液濃度對(duì)纖維膜細(xì)胞活力的影響 種植有BMSCs的不同濃度的PCL、PLA和PVA納米纖維膜的CCK-8 檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖7。圖7a 和圖7b 表明，與對(duì)照組相比，不同濃度的PCL和PLA納米纖維膜均可促進(jìn)細(xì)胞增殖（均P＜0.05），并且細(xì)胞活力隨著濃度的增加而增加（均P＜0.05），而圖7c表明，不同濃度的PVA的細(xì)胞活力均較對(duì)照組低（均P＜0.05）。

表10 不同接收速度所得的PCL電紡纖維膜的力學(xué)性能

表10 不同接收速度所得的PCL電紡纖維膜的力學(xué)性能

與20 r/min組比較，***P＜0.001

表11 不同接收速度所得的PLA電紡纖維膜的力學(xué)性能

表11 不同接收速度所得的PLA電紡纖維膜的力學(xué)性能

與20 r/min組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

表12 不同接收速度所得的PVA電紡纖維膜的力學(xué)性能

表12 不同接收速度所得的PVA電紡纖維膜的力學(xué)性能

與20 r/min組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

種植有BMSCs 的不同濃度的PCL 納米纖維膜的活死細(xì)胞染色結(jié)果，見(jiàn)圖8。與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加，PCL納米纖維膜上的細(xì)胞數(shù)量增多密度增大。

2.6 接收速度對(duì)纖維膜細(xì)胞活力的影響 從不同濃度的纖維膜中選出力學(xué)性能較好的濃度，分別為6%、10%、0.8%的電紡PCL、PLA 和PVA 3 種纖維膜，將接收速度分別設(shè)置為20 r/min、80 r/min 和140 r/min。對(duì)通過(guò)不同接收速度所制備的纖維膜進(jìn)行CCK-8 檢測(cè),結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同接收速度的PCL和PLA納米纖維膜均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞活力隨著接收速度的增加而增加，見(jiàn)圖9a和圖9b，而當(dāng)接收速度為20 r/min時(shí)，細(xì)胞活力低于對(duì)照組，隨著接收速度的增加，細(xì)胞活力隨之改善，見(jiàn)圖9c。

通過(guò)不同接收速度所制備的PCL 電紡纖維膜的活死細(xì)胞染色結(jié)果，見(jiàn)圖10。結(jié)果表明，隨著接收速度的增加，細(xì)胞的形態(tài)被拉伸，沿著納米纖維的方向有序的生長(zhǎng)，細(xì)胞之間相互連接，趨于融合。

圖7 種植有BMSCs的不同濃度的PCL、PLA和PVA電紡纖維膜的cck-8檢測(cè)結(jié)果

圖8 種植有BMSCs的不同濃度的PCL電紡纖維膜的活死細(xì)胞染色結(jié)果

圖9 種植有BMSCs并通過(guò)不同接收速度所制備的PCL（a）、PLA（b）和PVA（c）電紡纖維膜的CCK-8檢測(cè)結(jié)果

圖10 種植有BMSCs并通過(guò)不同接收速度所制備的PCL電紡纖維膜的活死細(xì)胞染色結(jié)果

3 討論

靜電紡絲技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量較高、參數(shù)可調(diào)等優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用。改變參數(shù)和紡絲液濃度可以影響所制備出的納米纖維膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)功能，從而影響細(xì)胞在其表面的生長(zhǎng)狀態(tài)。

在電紡參數(shù)相同的情況下，溶液濃度較小時(shí)，電紡纖維膜表面易出現(xiàn)串珠，并且纖維直徑較小，隨著濃度的增加，纖維膜表面結(jié)構(gòu)得到改善并且纖維直徑增加。這是因?yàn)楫?dāng)溶液濃度過(guò)小時(shí)，溶液黏度較小，在電場(chǎng)中難以形成射流，聚合物分子鏈之間纏結(jié)不充分，在纖維表面形成一些珠狀結(jié)構(gòu)[8-9]。同時(shí)，隨著溶液黏度的增大，射流在電場(chǎng)中的分化能力得到了降低，導(dǎo)致纖維平均直徑增大[10]。隨著濃度的增加，納米纖維表面形態(tài)得到改善，串珠減少，這時(shí)納米纖維的結(jié)構(gòu)更好的模擬了細(xì)胞外基質(zhì)，可作為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的良好的支架。本研究結(jié)果表明，當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著接收速度的增加，納米纖維膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于規(guī)整，直徑逐漸變小，這是由于接收速度加快，纖維被過(guò)度拉伸，導(dǎo)致纖維的平均直徑縮小[11]。通過(guò)提高滾筒的接收速度來(lái)得到排列有序的納米纖維，從而提高納米纖維膜的促細(xì)胞生長(zhǎng)能力[12-14]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著接收速度的提高，納米纖維排列趨于有序的狀態(tài)，纖維直徑也隨之減小，從而增大了空隙，使細(xì)胞可以沿著纖維的方向有序生長(zhǎng)，較高的孔隙率有利于細(xì)胞粘附以及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。

參數(shù)與溶液濃度的改變不僅影響納米纖維膜的形態(tài)和直徑，也會(huì)影響其機(jī)械性能。當(dāng)其他參數(shù)相同時(shí)，隨著溶液濃度的增加，3種纖維膜的機(jī)械性能先升高后降低，這是由于當(dāng)紡絲液濃度較小時(shí)粘度也較小，此時(shí)分子鏈纏結(jié)不良，纖維膜表面結(jié)構(gòu)較差，導(dǎo)致機(jī)械性能較低；當(dāng)濃度逐漸升高時(shí)，力學(xué)性能得到改善[11]。當(dāng)濃度進(jìn)一步增加時(shí)，溶液黏度較大，電紡過(guò)程受到影響，因此，力學(xué)性能隨之降低。當(dāng)溶液濃度相同時(shí)，隨著接收速度的增加，3種纖維膜的機(jī)械性能隨之降低。這是由于隨著接收速度的增加，纖維被拉伸，直徑變細(xì)，纖維膜厚度變薄，纖維略微出現(xiàn)取向性，纖維之間的接觸點(diǎn)有所減少，導(dǎo)致纖維膜的機(jī)械性能變差[11]。

綜上所述，通過(guò)改變紡絲液濃度和紡絲參數(shù)可以改變PCL、PLA 和PVA3 種電紡納米纖維的表面形貌與直徑大小，從而進(jìn)一步影響了機(jī)械性能以及它們對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力。